作者：李燕兵， 袁 芳， 李红卫， 杨玉荣    作者单位：1.宁夏医科大学基础医学院形态试验中心，银川 760004;2.宁夏医科大学基础医学院医学病原生物与免疫学系，银川 760004

【关键词】  粪便检查;细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫;流行病学调查

           人体包虫病是由棘球属绦虫引起的幼虫病，又称棘球蚴病。对人体可造成严重危害的包虫病主要包括两种：一种是细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)引起的细粒棘球蚴，又称单房包虫病(cystic echinococcosis);另一种是多房棘球绦虫(E. multilocularis)引起的多房棘球蚴，又称泡球蚴病(alveolar echinococcosis)。两种包虫病均属于人兽共患寄生虫病。单房包虫病呈世界性分布，而多房包虫病主要分布于北半球。国内32个省市自治区中有23个省都有病例报道，其中甘肃、青海、西藏、宁夏、新疆、四川等地是两种包虫病的重流行地区[1]。

　　1 包虫病的传播及流行环节

　　棘球蚴绦虫的成虫寄生于终宿主犬科类食肉动物的小肠内，虫体成熟后，虫卵和成熟的孕节片可随粪便排出体外。中间宿主(主要是啮齿类动物以及一些家畜如羊、牛、马、猪等)食入活虫卵后，卵在小肠中孵化，六钩蚴钻入肠壁，随血流进入全身。多房包虫主要侵入肝脏，而单房包虫则主要停留于肝脏、肺脏、腹腔等，少部分可停留于其他身体部位导致慢性占位性损害。人通过接触终宿主粪便，误食粪便中排出的虫卵，或误食被虫卵污染的水、蔬菜、瓜果等而发生感染。犬科类动物作为终宿主在疾病的流行传播中起主要作用，是包虫病的主要传染源， 控制和治疗狗的感染对预防和控制包虫病的传播有着重要意义[2]。

　　2 检查方法的改进

　　过去的调查方法是用剖检犬科动物的方法发现被感染动物。这种方法检查准确率高，但用人力多，并耗时量大，并且可能不符合动物保护法规。而粪便检查方便、快捷、易操作、成本低、标本易获取，被广泛用于棘球绦虫初检和流行病学调查。但由于粪便中的孕节及虫卵排出可能不规律或在粪便中的分布可能不均匀，而且棘球属绦虫的虫卵与其它带科绦虫虫卵在形态上无法区别，导致粪便直接镜检查病原体的检出率较低，并且特异性不高。随着免疫学和分子生物学技术的发展，将以前沿用的直接观察粪便病原体的检查方法发展为检查病原体抗原或(和)遗传物质的方法，即由形态学检查发展为分子生物学检查病原体。从而使查找病原体为直接证据的诊断方法提高到生物学的水平，也使棘球绦虫粪便检查的敏感性和特异性有了很大的提高。

　　3 粪抗原检查(Copro-antigen Detection)

　　根据抗原与抗体特异性结合的原理，可在病原诊断中用已知抗体检测未知抗原。目前，用双抗体夹心酶联免疫吸附试验检查粪便中棘球蚴绦虫的虫体抗原或分泌抗原已广泛用于犬科动物绦虫病的诊断及流行病学调查中。Jenkins[3]等通过给狗喂食细粒棘球蚴头节，人工感染细粒棘球绦虫。感染后14～22d粪抗原检测即阳性，而虫卵排出最早在感染后30d，最慢在感染后90～100d。在对试验犬进行驱虫治疗后的2～3d粪抗原检查结果即阴性，该实验证明粪抗原检查具有早期诊断和疗效考核价值。柴君杰[4]等用细粒棘球绦虫成虫虫体抗原及其抗体建立的双抗体夹心ELISA在人工模拟犬粪标本中检出成虫虫体抗原的下限达5～2.5ng·mL-1，检测的OD值与抗原含量高度相关(r=0.98)。认为本法在检测粪抗原中具有足够的敏感性。因此，推荐可作为棘球蚴的常规监测方法推广应用。黄燕[5]等建立了系统的粪抗原检测方法，运用于四川省甘孜县达通玛区4个乡的580只家犬吡喹酮每6个月1 次驱虫前后的粪抗原进行监测。结果系统的敏感性为92.3%，特异性为80%，检测方法具有较高的特异性和敏感性，认为该方法可以在基层推广应用。粪便标本的处理和粪抗原的稳定性直接影响检测的结果，一些学者就这方面进行了研究。试验将收集的犬粪分别放于PBS液中-80℃冷冻3d和1%福尔马林的鳞酸盐缓冲液(PBS)70～80℃加热8 h，用ELISA检测结果并无差异[5]。这两种方法都可以灭活虫卵但不影响粪抗原的检出效果，但粪便加热的处理方法在一些没有条件的地方不但可以灭活虫卵防止生物污染，并且降低成本，减少操作环节。此外 Jenkins[3]等用ELISA检测新鲜的粪便标本和储存于不同温度的环境中6d在置于-20℃一年的粪便标本，发现检测结果类似，说明粪抗原的稳性较好。

　　通过现场应用证明，粪抗原检测方法操作简便、方便易行、敏感性高，虫体在成熟期前就能被检查。同时，检测时不需要新鲜粪便样本，粪便在自然环境中1 个月或-20℃冻存半年仍然可以用于检测，方便基层采样、送样和保存样本，可用于大规模的流行病学调查。

　　虽然粪抗原检测法有大量的优点，但同时也存在一定的缺陷。Deplazes[6]等用ELISA分别对狗、狐和猫进行了粪抗原检测，发现狗的虫荷>100敏感性92%，当虫荷<100敏感性29%;对59只狐狸检测中发现，虫荷>1000敏感性100%，当虫荷<1000敏感性73.9%。认为敏感性与感染的虫荷数有关。而自然感染棘球绦虫的动物往往虫荷数较少，在流行病学调查中易漏检使得流行病学调查资料的准确性下降。此外在试验中，不同实验室对粪抗原检查的交叉反应率报道高低不一，尤其是种属相近的绦虫之间可能出现较高的交叉反应[7]。因此，认为，如果用粪抗原ELISA检查阳性，而不能被其它方法进一步证实，应归属于假阳性。同时粪抗原检测法对两种包虫种/棘球绦虫间(即多房棘球绦虫Echinococcus multilocularis;细粒棘球绦虫E.granulosus)的鉴别准确率仅为87%～95%[6]。近年来一种更加敏感和特异的方法被用于棘球绦虫的诊断。

　　4 粪便病原体遗传物质检查(Copro-DNA PCR)

　　粪便病原体遗传物质可以来源于寄生虫卵，或寄生成虫的细胞及组织碎片等， 检查方法主要依赖于基因片段的多聚酶链反应(DNA-PCR)。根据特异基因设计的引物扩增目的片段，提取粪便标本中的DNA进行检测。此检查手段即能提高特异诊断水平，而且能提供虫种鉴定的证据。由于不同种包虫的流行环节不同，对人体的致病侵袭力，以及危害程度均不同[8]。因此所要求采取的干预措施也不同。虽然目前世界范围内调查的多房包虫的种内变异非常保守，但全世界已鉴定报道细粒棘球绦虫有10个变异株[9-10](表1)。这些细粒棘球株间存在不同的生物学特性和流行病学特性，有些株只在动物间流行，未发现侵袭人体。而大量研究表明细粒棘球绦虫G1株式世界上流行分布最广的一株，而且也是人最易感的一株[9]。因此，这也是细粒棘球绦虫G1株报道最多的原因之一。Dinkel[11]等扩增mt12SrRNA基因片段对细粒棘球绦虫G1株检测，该方法特异性达100%，因为用此基因片段对多房棘球蚴和细粒棘球绦虫G1、G6、G7株检测为阴性。tefanic[12]等用特异性引物EgIf/EgIr对细粒棘球绦虫G1株检测，即使只有一个虫卵也能被检测出，能够与多房棘球绦虫和其它带科绦虫虫卵区别，检测结果无假阳性，特异性达100%。认为在流行病学调查中有应用价值。Abbasi[13]扩增目的重复序列(EgG1 Hae Ⅲ)用于细粒棘球绦虫G1株的诊断，所有的标本均为阳性，即使在虫荷数为2个时检测结果依然呈阳性。而对7只感染多房棘球绦虫的狐(虫荷数4～1990)检测均为阴性，认为特异性高(100%)。Boufana[14]等对以上3种检测方法进行比较，发现“Dinkel[11]”和“tefanic[12]”检测最敏感，分别是73.3%和100%;而“Abbasi[13]”检测敏感性仅52.6%，但该方法最具有种特异性(90.9%)，但缺乏株鉴别特异性。因为用其检测细粒棘球蚴G1、G2、G4、G5、G6、G7株全部出现阳性结果[15];“Dinkel的PCR法”有种内交叉反应，但具有细粒棘球蚴G1株的特异性。因此，引物设计是PCR诊断的关键，引物的不同，检测的敏感性和特异性可能有差别。

　　虽然粪基因片段的多聚酶链反应(Copro-DNA PCR)方法具有较高的敏感性和特异性，但由于粪便样本中常存在PCR抑制物，使结果出现假阴性[11-13，16]。温浩[17]等认为使用多次纯化的方法以及在 PCR 反应体系中添加牛血清白蛋白可以降低抑制因子的作用，使方法的灵敏度提高。DNA的提取同样也影响实验的敏感性，目前就提高DNA的提取技术作了大量的研究。Nunes[18]等推荐在粪便样本DNA提取前用玻璃棒搅动，DNA 提取结果较好。实验还发现QIAmp DNA stool mini试剂盒操作简单快速，可以去除粪便样本中的的PCR抑制物，与在其它几种处理方法相比检测结果是最好的，如酚/氯仿、异戊丙醇和DNAzol试剂提取的DNA作PCR检测。酚/氯仿尽管比商业试剂盒便宜，但耗时长。异戊丙醇光敏并且易挥发，化学性质不稳定，因此提取效果可能会受到一定影响。目前尽管在一些地方将PCR作为包虫病的流行病学研究的筛检工具，但检查技术操作要求高，实验室设备昂贵，要求有专门的技术人员操作等条件限制，因此，将此检查法普及到现场应用受到限制。

　　因此，根据不同条件和实际情况，Al-Sabi[19]等对不同的粪便检测方法进行了比较，通过收集试验感染多房棘球蚴狐的粪便，在虫卵计数的基础上将感染分潜伏期(感染后2～29d)、高显露期(感染后30～70d)、低显露期(感染后71～90d)，对不同感染阶段收集的粪便标本都进行了显微镜、Copro-antigen- ELISA 、Copro-DNA PCR、egg-DNA PCR检测，在不同的感染阶段各个检测方法的敏感性不同。高显露期所有的检测方法敏感性均高，在潜伏期ELISA检测最敏感，而在低显露期镜检和egg-DNA PCR检测比ELISA和Copro-DNA PCR检测的敏感性高。在不同期各个检测方法的敏感性都不同。可以认为，用检查寄生虫遗传物(DNA-PCR)对粪抗原ELISA阳性标本进一步确证比用其它方法确认更好。

　　5 结语

　　粪便标本易获取，尤其有利于自然环境中感染的动物包虫病的流行病学调查，为包虫病的预防和控制提供可靠的资料。粪便镜检查虫卵方便、快捷但敏感性低易漏检;粪抗原的检测能够检测处于潜伏期的感染且易操作，常用于现场流行病学调查，但其敏感性与虫荷数相关;粪便遗传物质检测虽敏感性较高但其操作繁琐，技术要求及费用较高不适宜于现场推广应用。这3种检查方法各有其优缺点，需根据不同的检测目的及条件选择合适的检测方法。

　　粪便检查的另一优点是可以对环境中虫卵污染的土壤样本进行检测。Shaikevno[20]等收集来自流行地12个村庄120份土壤标本用PCR法检测发现在环境中普遍存在细粒棘球蚴绦虫的污染。由此可见，粪病原体分子生物学检查可为棘球蚴病的预防和控制方案制定提供直接的依据。表1 细粒棘球绦虫的虫株分布和宿主来源(Echinococcus granulosus，E.g.)[9-10]

　　虫株宿主来源地理来源虫株宿主来源地理来源 G1(普通羊株)绵羊英国，西班牙，中国，澳大利亚大陆，塔斯马尼亚，肯尼亚，乌拉圭，土耳其，约旦，黎巴嫩，意大利山羊尼泊尔牛阿根廷，伊朗，尼泊尔牛瑞士，荷兰人英国，西班牙，中国，塔斯马尼亚，肯尼亚，约旦水牛印度，尼泊尔山羊澳大利亚大陆，塔斯马尼亚，约旦，黎巴嫩人荷兰水牛荷兰，中国，肯尼亚，阿根廷G6(骆驼株)骆驼肯尼亚，苏丹，中国，伊朗，索马里骆驼肯尼亚，中国，尼泊尔牛中国猪印度，尼泊尔人阿根廷，尼泊尔袋鼠澳大利亚大陆绵羊伊朗G2(塔斯马尼亚羊株)绵羊塔斯马尼亚，阿根廷山羊肯尼亚人阿根廷G7(猪株)猪波兰，阿根廷G3(水牛株)水牛印度G8(鹿株)鹿美国G4(马株)马英国，芬兰，瑞士人美国 驴芬兰G9(?株)#人波兰G5(牛株)绵羊尼泊尔G10(麋株)麋/鸵鹿芬兰，瑞典，爱沙尼亚 #迄今为止，此株自然生存的中间宿主尚未查明，鉴定虫株用的寄生虫物质是取自被感染的人，而人不是其自然生活史宿主

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