【摘要】  青光眼实验模型有助于阐述青光眼的病因学和病理学并发展新的更为有效的治疗方法。本文主要介绍近年来常用的青光眼实验模型及损害评估技术的优势和限制。

【关键词】  青光眼;实验模型;损害评估

青光眼是以视神经萎缩和视野从外周向中央渐进性缺损为特征的神经退行性疾病，发病隐匿，是全球第二致盲眼病，确切发病机制尚不清楚。青光眼的眼内病变主要包括三个方面：(1)房水流出受阻，小梁网和巩膜色素层流出通道形态学和生化的改变，眼内压(Intraocular pressure, IOP)的增高;(2)视神经乳头(Optic nerve head, ONH)特异性的变化包括视网膜神经纤维的缺失，筛板压缩变薄、弓形后移、筛孔延长、细胞外基质改变(胶原蛋白、弹性蛋白、基膜连接蛋白、葡糖胺聚糖等)和神经胶质组织改变(星型胶质细胞活化、细胞外间质重构);(3)视网膜神经节细胞(Retinal ganglion cells，RGCs)渐进性的凋亡。

　　青光眼实验模型是研究青光眼生理、病理、药理等方面的主要手段，目前常用的是动物模型和组织细胞培养模型。

　　1 青光眼实验模型

　　1.1 动物实验模型

　　青光眼动物实验模型有助于阐述青光眼的病因学和病理学并发展新的更为有效的治疗方法。最理想的动物实验模型是猴子或猩猩，因为它们的筛板和人类最为接近，但基于社会伦理道德和费用方面的考虑，应用有所限制。其次是啮齿类，大鼠和小鼠的前房角结构和灵长类很相似，小梁网由小梁细胞覆盖的小梁纤维交织成网状并有真正的Schlemm管。小鼠房水动力学和人眼极为相似。不同的是啮齿类没有灵长类视神经乳头处具有的筛板，包括围绕神经节细胞纤维束的筛状板。但是，小鼠和大鼠视神经乳头的细胞层更广阔，星形胶质细胞层板状延伸与神经纤维轴突相互交错。此外，大鼠的视神经乳头有稀松垂直走向的小梁，内含胶原、弹力蛋白、层粘连蛋白和蛋白聚糖。这些优势使啮齿类动物模型成为研究青光眼常用的工具。

　　目前使用的啮齿类动物模型主要有(1)常压模型：玻璃体内注射兴奋性氨基酸、内皮素，视神经损伤、视网膜缺血——再灌注模型;(2)压力模型：自发性高眼压模型、持续光照模型、高渗盐水模型、激光光凝小梁网模型、巩膜静脉烧灼模型、巩膜静脉结扎模型、透明质酸前房注射、微球前房注射。Urcola等[1]报道大鼠前房每周注射含有或不含羟丙基甲基纤维素(Hydroxypropyl methyl cellulose，HPMC)的乳胶微球可导致眼压增高至少持续30周。(3)转基因模型：利用病毒载体使人MYOC突变株在小鼠眼内过度表达，导致IOP显著增加[2]。

　　1.2 组织细胞培养模型

　　组织培养和单细胞类型培养是快速比较不同药物治疗效果的工具，并允许直接调控细胞微环境。常用的组织细胞培养模型有：原始视网膜细胞混合培养;纯化RGCs培养;RGCs转染;视网膜移植培养;神经胶质细胞和其他支持细胞培养。通过细胞培养可以：分离和分选纯化细胞确定不同类型细胞的作用;遗传物质转染以过度表达或敲除某种特定基因;细胞内钙离子浓度、活性氧浓度的荧光成像，线粒体膜电位，细胞酸碱度和其他细胞生理学的测量。

　　2 青光眼损害的评估

　　适当的精确的青光眼损害评估技术和工具是研究不可或缺的，包括IOP测量、RGCs和视神经的功能形态学评估等。

　　2.1 IOP测量

　　高眼压是青光眼主要致病因素，许多动物模型的构建都要涉及IOP测量。啮齿类动物眼压测量根据是否穿刺角膜分为创伤性和非创伤性两种。创伤性测量包括微管插入法(Microcannulation)和非伺服微液吸管系统(Servonull micropipette system)。非创伤性测量包括TonoPen笔式眼压计，气动式眼压计(Pneumotonometer)，Goldmann平压式眼压计，Schiotz压陷式眼压计和TonoLab反弹式眼压计。最常用是TonoPen笔式眼压计，可测量清醒大鼠和小鼠的眼内压，优点是非创伤性和对角膜很柔和，重复测量不会造成任何不利视觉或全身性的影响。气动式眼压计适用于麻醉小鼠，优点是探头可用显微操纵器精细控制。Goldmann平压式眼压计是临床测量IOP的标准设备，具有与TonoPen相同的优点但昂贵不轻便并依赖操作者经验。Schiotz式压陷眼压计测量方法简单但操作前动物必须麻醉，影响了重复测量。TonoLab反弹眼压计获得的数据与微管插入法获得的实际IOP更为接近，可用于清醒小鼠无需角膜局部麻醉，操作简便，对操作者没有太多的经验要求。

　　2.2 RGCs的形态学评估

　　视网膜全层切片或视网膜铺片结合组织化学技术可将所有类型的细胞非特异性染色(如甲酚紫)或选择性的标记RGCs(逆行性标记或RGCs免疫组化标记)。

　　视网膜全层切片的优点是可以显示不同细胞层形态学变化，计数视网膜节细胞层(Ganglion cell layer, GCL)细胞数量，估计RGCs的存活率。缺点是正常视网膜RGCs的分布密度和青光眼患者或啮齿动物模型视网膜RGCs的缺失都是不均一的。其次，并非存在于GCL的所有的细胞都是RGCs，无足细胞(Amacrine cells)据估计高达50%，因此计数GCL的细胞不能准确反映RGCs的变化。

　　视网膜铺片用于检查整个视网膜，消除RGCs不均匀分布和不对称丢失导致的误差。组织学技术是视网膜铺片不可缺少的补充。

　　甲苯基紫染色：适当调整染色程序的参数，特别是染色和脱色的时间，可仅染色GCL，但观察者仍需凭借经验从形态上区分RGCs和无足细胞。

　　逆行荧光标记：RGCs是视网膜中唯一的轴突通过视神经到达上丘的细胞，通过上丘或视神经轴突横断面注射逆行性荧光分子理论上可仅标记RGCs。最常用的荧光标记物是胶体金(Fluorogold)、DiI、DiAsp和荧光标记的辣根过氧化物酶。葡聚糖四甲基罗达明(Dextran tetramethylrhodamine, DTMR)生物半衰期短暂且必须经视神经横断面注射而较少应用。逆行荧光标记的缺点是：颅内注射或视神经切断都会给动物额外的创伤;经上丘注射的大鼠视网膜实际标记数RGCs只有80%-85%，同时染料也可能因被受损或死亡RGCs释放并被视网膜其他细胞如小胶质细胞、中性粒细胞和周细胞摄取。因此，并非所有标记细胞必定是RGCs;标记可能对RGCs产生破坏效应。例如DTMR经视神经横断面注射会导致RGCs死亡，胶体金可在注射部位造成轴索变性。

　　免疫组化：使用抗RGCs的特殊标记可仅标记RGCs。如Thy1, Brn3B和神经丝蛋白NFL。适当的免疫组化加上自动细胞计数，是定量研究RGCs强有力工具。

　　细胞凋亡定量分析：最常用的是TUNEL(末端转移酶右旋尿苷三磷酸断口端标记),可选择检测与RGCs凋亡有关的DNA碎片。但无法区分细胞凋亡和坏死都会发生的单链和双链DNA断裂;⑵YOYO1，能标签凋亡中断裂的染色质。Tatton等[3]建议，有必要同时使用TUNEL法和YOYO1共同确认细胞凋亡;荧光衍生的膜联蛋白V(Annexin V)：这种蛋白能够和凋亡细胞上特异出现的磷脂酰丝氨酸结合,指示细胞从正常状态进入凋亡过程。细胞凋亡定量分析的局限是只针对细胞死亡的特殊阶段，而细胞凋亡或死亡至少要24小时以上，此阶段外的受损细胞无法被标记，因此也会低估计数水平。

　　值得注意的是Higashide等人[4]用激光扫描检眼镜成功拍摄并计数活体大鼠眼内的RGCs。利用上丘注射染料DiA后再电子成像，DiA可以稳定存在长达2个多月，成像是非创伤性的，可重复检测，因此可提供视网膜RGCs数量和密度的连续变化。

　　2.3 视神经的形态学评估

　　视神经形态学评估能提供比RGCs评估更有价值的信息。视神经横断面染色后可以借助光学或电子显微镜观察形态学变化和定量评估存活或损伤的轴突数目，估计轴突损伤情况并显示优先受损区域。目前常用视神经损伤评估系统(Optic nerve damage score，ONDS)，可方便快速评估视神经整体损伤情况。

　　2.4 ONH的形态学评估

　　青光眼损害的特征性改变是ONH杯状凹陷和筛板向后突出。眼底镜检查，眼底照相，激光扫描眼底配合前房角镜可专门检测啮齿动物活体内视盘杯状凹陷情况，激光断层扫描可以清晰表明眼内高压小鼠视盘杯状凹陷随时间发展变化。

　　2.5 其他

　　RGCs特殊标记Thy1和NFL生化定量分析：视网膜mRNA水平的Thy1和NFL生化定量分析可以用逆转录聚合酶链反应(PCR)或定量实时逆转录PCR，后者更为敏感和可靠。有研究表明Thy1 和NFL在实验损害后和可以观察到的RGCs死亡之前呈减量调节[5]，这表明RGCs在真正可证实的死亡和细胞缺失前存在一重要的功能受损期。测量RGCs标记物mRNA水平可能是细胞损害的敏感的意义深远的指标。

　　电生理评价：灵长类青光眼损害的功能评价可以是活体的身心或电生理评价。不幸的是，目前的技术限制了对啮齿类动物身心评价的研究。常用的电生理评价如视网膜电流图(ERG)、图形视网膜电图(PERG)、多焦视网膜电图(mfERG)，视觉诱发电位(VEP)、多焦视觉诱发电位(mfVEP)。

　　瞳孔对光反射(PLR)：是评估功能完整的或视觉疾病损害的视网膜和视神经功能的敏感方法，已在小鼠和大鼠被证实具有特征性。

【参考文献】
  　1 Urcola JH,Hernandez M,Vecino E. Three experimental glaucoma models in rats:comparison of the effects of intraocular pressure elevation on retinal ganglion cell size and death[J]. Exp Eye Res, 2006, 83: 429-437.

　　2 Shepard AR,Jacobson N,Millar JC,et al. Glaucomacausing myocilin mutants require the peroxisomal trgeting signal1 receptor(PTS1R)to elevate intraocular pressur[J]. Hum Mol Genet, 2007, 16: 609-617.

　　3 Tatton NA,Tezel G,Insolia SA,et al. In situ detection of apoptosis in normal pressure glaucoma.A preliminary examination[J]. Surv Ophthalmol, 2001, 45(suppl 3): 268-272.

　　4 Higashide T,Kawaguchi I,Ohkubo S,et al. In vivo imaging and counting of rat retinal ganglion cells using a scanning laser ophthalmoscope[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2006, 47: 2943-2950.

　　5 Chidlow G,Casson R,Sobrado Calvo P,et al. Measurement of retinal injury in the rat after optic nerve transection:an RTPCR study[J]. Mol Vis, 2005, 11: 387-396.