作者：陈晨1,2江舟1王正荣1    作者单位：(1.四川大学卫生部时间生物学重点实验室成都610041;2.四川省绵阳科学城医院 绵阳 621900)

【摘要】  本文对生物钟基因研究的最新进展进行了综述。重点阐述了近日钟基因通过自身的转录、翻译和调控形成近日节律的过程。介绍近日钟基因在心血管系统中的重要地位。

【关键词】  生物钟;基因;心血管病;时间生物学

The relationship between the clock gene and cardiovascular diseases

　　Chen Chen1，2, Jiang Zhou1 , Wang Zhengrong1

　　(1.Health Ministry of China Key Lab of Chronobiology, Sichuan University, Chengdu, Sichuan 610041;

　　2.Science City Hospital, Mianyang, Sichuan 621900)

大量的研究表明地球上的生物，从单细胞生物，如细菌，到高等生物(如人类)的生命活动均存在着生物节律的特征，特别是近日节律(circadian)[1-3]。这些生物节律的产生是地球生物为了适应其生存环境的周而复始的变化(如地球昼夜变化、四季变化)通过不断衍变进化而形成的机体内固有的节律，故被称为内源性固有节律。近年来关于机体的生物节律产生的物质基础已有了非常深入的研究，并取得了长足的进展，特别是1997年当King DP等[4]克隆出哺乳类动物的第一个近日钟基因clock后，接下来的十多年里，近日钟基因不断被发现和克隆出来，同时这些基因间如何通过转录、翻译和调控形成自激振荡产生近日节律的过程也不断得到阐明。近而对基因在维持机体正常生理功能以及一些疾病发生发展过程中所起的作用也不断得到揭示和阐明。

　　1 近日钟基因及其产生近日节律的过程

　　近日钟基因是由一组能够通过自身转录、翻译、反馈调控而产生自激振荡的基因所组成。目前对于近日钟基因的自激振荡而产生近日节律的描述有许多，如细菌、植物、果蝇、小鼠等[5-10]均有不同的描述和近日钟模型。在哺乳类动物中常见的近日钟基因有per1、per2、per3、clock、Bmal1、Cry1、cry2、Reverb2、time、CK1ε等(如图1所示)。图1小鼠近日钟基因表达调控产生近日节律的模式图

　　大量的研究表明，当哺乳类动物的细胞内的近日钟基因clock和bmal1，或clock和npas2基因表达时产生相应的蛋白质，并分别形成具有基因转录活性的异二聚体CLOCK：BMAL1或NPAS2：BMAL1(该异二聚体主要在中枢系统)。在这二个异二聚体中由于上述这三种蛋白中均含有bHLH结构域，它能与许多启动子上游带有Ebox的基因结合，从而激活这些基因的转录。

　　在近日钟基因中per1、per2、per3、cry1和cry2的启动子上游均带有Ebox序列，因此CLOCK：BMAL1和NPAS2：BMAL1分别可以与这些基因调控序列结合，激活这些基因转录分别产生per1、per2、per3(统称为pers)cry1、cry2(统称为crys)mRNA，当clock、bmal1和npas2表达强产生相应的蛋白多形成异二聚体量大，对上述钟基因转录活性强，这样形成一条正反馈环路，正如图1所示。在核内产生的这些mRNA逐渐通过一定方式到细胞浆合成相应的蛋白质PER1、PER2、PER3、CRY1和CRY2等，随着这些蛋白在胞浆的聚集增多乃至达到峰值，同时，络氨酸激酶(CK1ε)将被激活，激活后的CK1ε将对这些蛋白进行磷酸化，磷酸化后的这些近日钟蛋白将形成二聚体并返入核内。入核后的这些近日钟蛋白的二聚体将会对CLOCK：BMAL1和NPAS2：BMAL1形成负反馈抑制，从而造成二者的转录活性下降，形成了第一条负反馈环路。随着返入核内的PERs和CRYs逐渐增多，对CLOCK：BMAL1和NPAS2：BMAL1的pers和crys等基因转录活性的抑制不断增加，造成pers和crys等基因的转录不断降低直到谷底，这样细胞浆中合成的PERs和CRYs钟蛋白的浓度也随之降至低谷。接下来这些蛋白的磷酸化以及返入核内也降到最低，对CLOCK：BMAL1和NPAS2：BMAL1抑制被解除，这时CLOCK：BMAL1和NPAS2：BMAL1对pers和crys转录激活再一次开始，即进入下一个周期。这样近日钟基因经过上述转录、翻译和反馈调控形成周而复始的不断的周期性振荡从而产生近日节律。上述这些近日钟基因转录、翻译和反馈调控形成的周期振荡，每一个周期大约要耗时接近于24小时，因此，现代时间生物学之父F.Halberg将内源性的一日节律命名为近日节律(Circadian rhythm)。

　　在图1中，还可以看到近日钟基因在周期性振荡过程中还受到Reverb2等基因的调控，在Reverb2基因的启动子上游亦有Ebox序列，通常受到CLOCK：BMAL1的结合和转录激活，表达产生REVERB2蛋白，当其浓度增高时能与RORα竞争性地结合bnail1基因启动子区的视黄酸相关受体反应元件(ROREs)，从而抑制bmal1基因的表达，使得BMAL1浓度降低，造成CLOCK：BMAL1异二聚体浓度降低，使其对pers、crys等近日钟基因的转录激活减弱。因此，Reverb2等基因在近日钟基因的周期性自激振荡过程中，扮演了第二条负反馈环路的角色。另外，还有其他一些近日钟基因在这些调控过程中也参与了调控，还有新的近日钟基因不断被发现。迄今为止，基于钟基因表达调控形成的近日节律学说被大家广为接受。

　　然而，近日钟基因所形成的生物大分子周期性自激振荡产生的近日节律只有通过相应的输出系统将这种自激振荡产生的近日节律输送到效应组织和器官，通过一定的整合放大方能产生相应的近日节律，进而对机体的机能产生影响，如血压，体温以及其他生理生化指标的节律性变化。目前为大家所推崇的输出通路是钟控基因通路。如图1所示，CLOCK除与BMAL1结合对pers、crys等近日钟基因转录、激活外，CLOCK还与许多在启动子上游带有Ebox序列的基因相结合，促使这些基因转录激活,调控这些基因表达，将上述近日钟基因自激振荡产生的近日节律输出到震荡系统之外，然后再到达效应组织和效应器官等产生相应的近日节律，使机体机能适应环境的变化。由于这些带有Ebox的基因受控于CLOCK，因此，这一些基因被称为钟控基因(clock controlled gene，简写为CCGs)。另外，CLOCK还能与转录因子dbp、hlf和tef等因子的Ebox结合激活和促进这些转录因子表达增加产生相应的蛋白DBP、HLF和TEF，这些蛋白质即转录因子可进一步与其他钟控基因结合，促进这些钟控基因表达产生相应的反应，将近日钟基因自激振荡调控产生的近日节律输出到相应的效应组织、器官等去产生相应节律，以维持机体的内环境平衡并适应环境变化。

　　目前，大量研究证实，近日钟系统包括近日钟基因和钟控基因等功能正常与否不仅维系着机体正常生物节律的作用，而且还维持着机体的其他机能正常作用。当近日钟系统异常或其基因突变时，机体正常机能将被打乱，甚至产生一些疾病，如心血管疾病、神经系统疾病以及肿瘤等。

　　2 近日钟系统在心血管疾病中的作用

　　大量的临床研究资料表明心脑血管系统功能以及心脑血管疾病的发病过程均表现出时间生物学的规律，即存在着近日节律的特征。在正常人群无论是成人，还是儿童乃至新生儿，其心血管机能，如心功能、心肌收缩力、脑血流速度、血压、心率、心电图等变化均存在着近日节律。通常情况下，这些心脑血管系统机能变化均是以夜间低、白昼高，下午达到峰值的近日节律的特征。当在疾病状态下，如心肌梗塞、心猝死、脑血栓形成、脑出血等，也表现出近日节律的特点，通过心肌梗塞、心猝死及脑血栓形成常发生在凌晨，而脑出血性中风发生在午后[11-16]。Guan等[17]对脑出血性中风患者的血压进行了连续24小时检测并持续一周后，然后对这些脑出血性中风患者的血压的生物节律进行了分析，他们发现：当中风后第一个24小时血压仍存在近日节律的患者，其预后明显较中风后第一个24小时血压近日节律消失的患者好，这为临床上判断脑出血性中风患者的预后提供新的途径。其实这些心脑血管机能和心脑血管疾病发病的时间生物规律，或者生物节律是否存在是受到机体内的近日钟系统调控和影响。

　　Mortino等[18]研究发现在小鼠心肌组织中表达的基因，13%的基因都表现出近日节律的变化规律，进一步对这些基因的研究表明这些基因的表达，即从mRNA到蛋白水平的表达过程是受到近日钟基因振荡调控。这些在心肌呈近日节律表达的基因多与信号传导、心肌细胞代谢等过程有关。他们通过缩窄老鼠的主动脉造成心脏后负荷过重所引起的心室肥厚的动物模型。然后打乱这些心室肥厚动物外环境的节律来引起动物的生物节律的紊乱，结果发现这些近日节律紊乱的动物心室舒张末期和舒张末期的容积增加，心室收缩力下降。通过基因分析发现造成这种现象的原因是近日钟基因per2和bmal1的近日表达被打乱，从而引起ANF、BNP和ACE等表达下调，使得心肌收缩力下降。这一研究结果说明生物节律正常与否对于维持心脏功能有着重要的作用，当近日节律紊乱后，会造成心脏功能，特别是病理状况下的心脏功能下降。Portaluppi F等[19]报道当生活环境变化，特别是昼夜活动规律，即人类的近日节律被打乱后，血压的近日节律将随之发生变化，甚至造成高血压的发生。探讨原因是机体的近日节律被打乱时，会引起自主神经以及神经体液等发生变化，以及调节失控从而导致心血管系统发生变化，严重是会造成高血压等心血管疾病的发生。这些研究结果说明当机体生物节律发生变化时，会造成近日钟基因的表达失调，这将会造成参与心血管系统调控的钟控基因表达受到影响，进而影响正常的心血管系统的调控，使其发生病理变化。上述研究报道主要是说明生物节律变化对心血管系统的影响和疾病关系。

　　另外，还比较常见的是近日钟基因的突变或表达异常，常导致心血管疾病的发生。Bray MS等[20]对clock突变的小鼠心肌收缩力进行了研究，结果发现当clock基因突变后小鼠的心肌收缩力、代谢功能以及相关基因表达均发生了改变，也就是说当clock基因突变时易导致小鼠发生心血管疾病。Takeda N等[21]采用基因芯片检测技术对血管内皮细胞表达钟控基因进行了分析检测，他们发表有229个基因其内CLOCK/BMAL2上调。其中TM(凝血调节蛋白)也是受CLOCK/BMAL2调控的钟控基因。他们通过研究发现TM无论是mRNA还是蛋白质表达均呈现出近日节律的特征。进一步用报告基因分析、电泳分析和免疫共沉淀分析证明，当CLOCK/BMAL2与TM基因上游的启动子Ebox结合后，会引起TM启动子的转录激活，促进TM的表达。当clock突变之后TM基因表达的近日节律发生消失。他们这一研究结果提示存在于如血管内皮细胞中的外围生物钟调节着TM基因的近日节律性表达，这可能与心血管意外的近日节律性有密切关系。Durgan DJ等[22]对心肌细胞中的近日钟基因在不同条件下的表达进行了研究，他们观察到体外培养的心肌细胞在脂肪酸的作用下其近日钟基因表达响应仍存在着近日节律的特征;同时这些体外培养的心肌细胞对12小时光照/12小时黑暗的光暗循环作用时表现出对脂肪酸的刺激响应与整体动物同样光导引下产生的代谢响应相同。他们的研究表明心肌的代谢过程是受到心肌细胞中的近日钟基因的调控。心血管机能以及心血管疾病大多表现出近日节律的变化规律是由于心血管系统既受控于来自中枢和心血管系组织细胞中本身的近日钟系统的调控的结果。但是近日钟系统如何来调控，特别是如何参与调控心血管疾病的发生发展是人们所关心的。例如心肌梗塞或心绞痛常发生于早晨，近日钟系统在该病中的作用逐渐被揭示。

　　钟控基因产物之一PAI1(血浆纤溶蛋白溶酶原激活抑制因子1)在正常情况下表现出近日节律。Maemura K等[23]采用酵母双杂交技术对人脐带血管内皮细胞cDNA进行分析，发现CLIF(又叫BMAL2)能与CLOCK结合形成二聚体，在内皮细胞中CLOCK：CLIF形成的二聚体能与PAI1基因的Ebox结合促进其上调表达产生PAI1，形成近日节律。这也许是心肌梗塞或心绞痛常见于早晨的关键因素。tPA与PAI1是一对矛盾体，二者的相对水平决定着血栓和心肌梗塞及其预后。Ganti AK等[24]进而对42位患心肌梗塞患者的tPA(组织血浆纤维蛋白溶酶原激活因子)与PAI1二者的相对水平进行了研究，虽然tPA:PAI1的比值在早晨的最高值与心肌梗塞未表现出统计学意义，但是患者的PAI1的近日节律消失具有高血压的心肌梗塞患者较无高血压患者的tPA明显降低。Ohkura N等[25]对近日钟基因突变小鼠的凝血和纤溶活性进行了研究，通过研究发现未突变小鼠在21:00纤溶活性最低;在clock突变小鼠中纤溶活性一直很低;在cry1/2基因敲除的小鼠纤溶活性增强，并且无昼夜差异。进一步的探讨这些变化的原因观察到clock基因突变小鼠的PAI1的近日节律消失，而且这些动物血清中血纤维蛋白溶酶原的水平明显高于未突变小鼠和cry1/2基因敲除小鼠。同时，未突变小鼠和cry1/2基因敲除小鼠的tPA，血纤维蛋白溶酶原，α2PI无论是血清中的活性，还是mRNA表达水平都保持同一稳定水平，无节律存在。凝血因子，如VII因子、X因子、凝血素和纤维蛋白原不受clock基因突变的影响。这一研究结果表明clock基因在调控PAI1从而影响纤溶系统，进而使影响凝血系统扮演着重要的角色。Ohkura N等[26]还进一步对不同种属的小鼠，如Jcl:ICR, C3H/HeN, BALB/cA,和C57BL/6J种小鼠的PAI1表达的近日节律，及其凝血物和血纤溶蛋白等的近日节律进行了研究。通过研究发现：所有的小鼠凝血物没有近日节律变化，但其活动项较高;只有Jcl:ICR小鼠的血浆抗凝血酶和蛋白C的活性呈近日节律变化，其他小鼠保持恒定水平。而血浆凝血素，X因子，VII因子，凝血酶原时间，APTT 等各种小鼠均为稳定水平。这一结果提示血栓形成是否表现出世界生物学的规律是直接受遗传素质影响，这在临床上有重要的意义。

　　通过以上的结果，我们可以看到生物节律和近日节律基因表达正常与否将会心血管机能，进而引起心血管疾病。在今后对心血管疾病的诊断、治疗和预防

　　中，时间生物学和节律基因等因素应给以高度重视。

【参考文献】
  　　1 Aschoff J. Circadian rhythm in man in isolation[J]. Verh Dtsch Ges Inn Med. 1967, 73(4): 941-942.

　　2 Ungar F, Halberg F. Circadian rhythm in the in vitro response of mouse adrenal to adrenocorticotropic hormone[J]. Science. 1962, 137(3):1058-1060.

　　3 Sargent ML, Briggs WR, Woodward DO. Circadian nature of a rhythm expressed by an invertaseless strain of Neurospora crassa[J]. Plant Physiol. 1966, 41(8):1343-1349.

　　4 King DP, Zhao YL, Ashvin MS, et al. Positional cloning of the mouse circadian clockgene[J]. Cell, 1997,89(5):641-653.

　　5 Sun ZS, Urs Albrecht, Zhuchenko O, et al. RIGUI, a putative mammalian ortholog of the drosophila period gene[J]. Cell 1997, 90(8):1003-1011.

　　6 Hardin PE. The circadian time keeping system of Drosophila[J]. Curr Biol. 2005,15(17):R714-722.

　　7 BellPedersen D, Cassone VM, Earnest DJ, et al. Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms[J]. Nat Rev Genet. 2005,6(7):544-556.

　　8 BeckerWeimann S, Wolf J, Kramer A, et al. A model of the mammalian circadian oscillator including the REVERBalpha module[J]. Genome Inform. 2004,15(1): 3-12.

　　9 Petri B, Stengl M. Phase response curves of a molecular model oscillator: implications for mutual coupling of paired oscillators. J Biol Rhythms. 2001,16(2):125-141.

　　10Vilar JM, Kueh HY, Barkai N, et al. Mechanisms of noiseresistance in genetic oscillators[J]. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002,99(9):5988-5992.

　　11Wang Z, Chen L, Wan C, et al. In vitro circadian ANP secretion by gene transferring cells encapsulated in polycaprolactone tubes: gene chronotherapy[J]. Peptides. 2004, 25(8):1259-1267.

　　12Wang Z, Wang L, Zhang L, et al. Circadian relations among cardiovascular variables of young adults[J]. Chronobiologia. 1992, 19(3-4):111-120.

　　13Wang Z, Sun X, Cornelissen G, et al. Doppler flowmeterassessed circadian rhythms in neonatal cardiac function, family history, and intrauterine growth retardation[J]. Am J Perinatol. 1993, 10(2):119-125.

　　14Chen LG, Wang ZR, Wan CM, et al. Circadian renal rhythms influenced by implanted encapsulated hANPproducing cells in Goldblatt hypertensive rats[J]. Gene Ther. 2004, 11(20):1515-1522.

　　15Hassler C, Burnier M. Circadian variations in blood pressure : implications for chronotherapeutics[J]. Am J Cardiovasc Drugs. 2005, 5(1):7-15.

　　16Bursztyn M. Parallel morning and evening surge in stroke onset, blood pressure, and physical activity[J]. Stroke. 2002, 33(10):2346-2347.

　　17Guan J, Ding Y, Liu Y, et al. Circadian effects on outcome following surgery for intracerebral hemorrhage in humans[J]. Brain Res. 2009, 1258(1):78-85.

　　18Martino TA, Tata N, Belsham DD, et al. Disturbed diurnal rhythm alters gene expression and exacerbates cardiovascular disease with rescue by resynchronization[J]. Hypertension. 2007, 49(5):1104-1113.

　　19Portaluppi F, Cortelli P, Provini F, et al. Alterations of sleep and circadian blood pressure profile[J]. Blood Press Monit. 1997,2(6): 301-313.

　　20Bray MS, Shaw CA, Moore MW, et al. Disruption of the circadian clock within the cardiomyocyte influences myocardial contractile function, metabolism, and gene expression[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2008, 294(2):H1036-H1047.

　　21Takeda N, Maemura K, Horie S, et al. Thrombomodulin is a clockcontrolled gene in vascular endothelial cells[J]. J Biol Chem. 2007,282(45):32561-32567.

　　22Durgan DJ, Trexler NA, Egbejimi O，et al. The circadian clock within the cardiomyocyte is essential for responsiveness of the heart to fatty acids[J]. J Biol Chem. 2006, 281(34):24254-24269.

　　23Maemura K, de la Monte SM, Chin MT, et al. CLIF, a novel cyclelike factor, regulates the circadian oscillation of plasminogen activator inhibitor1 gene expression[J]. J Biol Chem. 2000，275(47):36847-36851.

　　24Ganti AK, Potti A, Yegnanarayan R. Plasma tissue plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor1 levels in acute myocardial infarction[J]. Pathophysiol Haemost Thromb. 2002,32(1):80-84.

　　25Ohkura N, Oishi K, Fukushima N, et al. Circadian clock molecules CLOCK and CRYs modulate fibrinolytic activity by regulating the PAI1 gene expression[J]. J Thromb Haemost. 2006,4(11):2478-2485.

　　26Ohkura N, Oishi K, Sakata T,et al. Circadian variations in coagulation and fibrinolytic factors among four different strains of mice[J]. Chronobiol Int. 2007,24(4):651-669.