作者：张雄鹰1 武延隽1 程红兵1 秦雄伟2    作者单位：(长治医学院1.微生物学教研室;2.附属和济医院门诊部山西长治， 046000)

【摘要】  目的：定量检测正常人血清中可溶性人白细胞抗原Ⅰ(sHLAⅠ)，以探讨山西汉族人群的正常参考值。方法：ELISA法检测血清sHLAⅠ类抗原水平。将不同浓度的标准品和待检血清分别加入包被有特异性sHLAⅠ抗体的酶标板，与生物素化的sHLAⅠ、辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素共同孵育，弃上清并用洗涤液洗涤，加底物应用液四甲基联苯胺(TMB)显色，以酶标仪450nm测定吸光度值，根据不同浓度标准品显色后测得的吸光度值绘制标准曲线，测定60例健康山西人的sHLAⅠ含量。结果：ELISA法能够准确检测sHLAⅠ含量，60例健康山西人的sHLAⅠ含量为(382.62±106.68)ng·ml-1。结论：山西汉族人群sHLAⅠ正常值为(382.62±106.68)ng·ml-1。

【关键词】  可溶性人白细胞抗原Ⅰ;酶联免疫吸附试验;定量检测

1970年Van Rood 等首先从正常人血清中检测到可溶性人白细胞抗原Ⅰ(sHLAⅠ)[1]。现已从人类的血液、淋巴液、尿液、乳汁等体液中检测出sHLAⅠ类抗原。目前认为sHLAⅠ类抗原与器官/组织移植、病毒感染、肿瘤、自身免疫性疾病等的临床表现及预后有关[2-3]。健康个体中其浓度与种族及遗传背景有关[4]。追踪文献，目前尚未见有关山西汉族sHLAⅠ的定量检测及正常值的报道。我们通过定量测定健康人血清中sHLAⅠ的表达，探讨山西人群的正常参考值。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源

　　60例无亲缘关系的山西籍健康人(女36，男24)，为长治医学院附属和济医院健康体检者及健康志愿者，年龄20～57岁。收集上述对象外周静脉血3～5ml，经离心后(3000r·min-1，5～10 min)取血清样本。

　　1.2 主要试剂和仪器

　　可溶性HLAⅠ检测试剂盒(ADL产品)，ANTH.S 2010酶标仪。

　　1.3 方法

　　在已包被特异性sHLAⅠ抗体的酶标板中依次分别加入100μL浓度为0、0.5、1.0、2.5、5.0、10ng·mL-1的标准品(每个浓度加三个复孔);每孔中再加生物素化的sHLAⅠ及辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素50μl;37℃孵育60min，弃上清并用洗涤液洗涤5次;每孔中加入底物应用液四甲基联苯胺(TMB)100μl，37℃避光孵育15min，加入50μl终止液终止反应。在30min内以酶标仪450nm测定吸光度(A)值。被测血清做1：200稀释后，按上述方法测定sHLAⅠ含量。

　　2 结果

　　2.1 标准曲线sHLAⅠ标准品含量为0、0.5、1.0、2.5、5.0、10 ng·ml-1时，OD值分别为1.383、0.839、0.650、0.465、0.343、0.117，标准品OD值记为B，标准品0点OD值记为B0，以B/B0为纵坐标，标准品的浓度为横坐标，在对数坐标纸上绘制标准曲线，如图1所示。sHLAⅠ含量的对数与B/B0呈线性相关，经过SPSS13.0统计软件分析，其相关指数R2=0.991，回归方程为Y= -0.1662Ln(X) + 0.4864，X=e(Y-0.4864)/(-0.1662)。

　　2.2 对照样本 以血红蛋白液、BSA代替被检血清，3个复孔，OD值为1.343～1.401，分析结果为阴性。

　　2.3 敏感度本试剂盒敏感度为0.01 ng·ml-1。

　　2.4 精确度随机抽取17号样本，分别重复6次，测得批内变异系数为4.87%;同一样品连续测定5d，测得批间变异系数为6.58%。

　　2.560例山西人样本 OD值/标准品0点OD值，经回归方程计算出各自的sHLAⅠ含量，用统计学软件SPSS 13.0进行统计学处理，结果表明山西人sHLAⅠ的浓度最低为206.59 ng·ml-1，最高为592.26 ng·ml-1，平均值范围(382.62±106.68)ng·ml-1。

　　图1 sHLAⅠ类抗原ELISA测定标准曲线

         3 讨论

　　1970年Van Rood 等用淋巴细胞毒抑制试验在正常人血清中检测到了HLAA2，从而证实了可溶性HLAⅠ抗原的存在[1]。目前检测sHLAⅠ类抗原常用的方法有：微量细胞毒抑制试验、流式细胞术抑制法、单向等电聚焦电泳以及ELISA法等。微量细胞毒抑制试验的优点是需试剂少、操作简便，但只能定性不能定量，抗血清的质量直接影响试验结果。流式细胞术抑制法则需要特殊设备，且试剂用量大，价格昂贵。单向等电聚焦电泳可检测sHLAⅠ类抗原的同种异型，但操作繁琐，且不能定量。而目前广泛使用的酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗体夹心法具有很好的敏感性和可重复性。Kao于1986年使用ELISA竞争法测出健康人血清sHLAⅠ类抗原含量为(1470±870)ng·ml-1，首先建立了血清sHLAⅠ类抗原的定量检测方法，该方法结果判断准确、客观，具有满意的敏感性，可以通过酶标仪进行自动分析，易于标准化，重复性好，可以进行大批量检测。我们选择ELISA竞争法，应用试剂盒进行sHLAⅠ类抗原水平测定，试剂盒敏感度为0.01ng·ml-1，灵敏度较高;批内变异系数为4.87%，批间变异系数为6.58%，重复性较理想;血红蛋白、BAS代替血清实验，均不产生假阳性，特异性高。

　　利用ELISA竞争法，我们测定本组山西汉族人sHLAⅠ类抗原水平为(382.62±106.68)ng·ml-1。不同文献报道正常人血清中sHLAⅠ类抗原水平为：(990.00±160.00 )ng·ml-1(美国)，254 ng·ml-1(美国)，(100.00～600.00 )ng·ml-1(意大利)，(868.90±715.0 0)ng·ml-1(日本)，(415.60±256.10) ng·ml-1(韩国)[4-8]，各国结果表现出较大的地区差异性。研究表明，sHLAⅠ类抗原水平不仅有地区差异性，而且有着明显的种族差异性，如Wolf对不同种族美国人的sHLAⅠ类抗原水平研究发现，非裔美国人的sHLAⅠ类抗原水平为292.2 ng·ml-1，美国白种人为190.5 ng·ml-1，佐治亚人为348.3 ng·ml-1，表现出较大的种族差异性[4]。血清sHLAⅠ类抗原含量尚与个体HLAⅠ类抗原表型有关，McDonald等对209名高加索人的研究表明，血清sHLAⅠ类抗原水平呈双峰分布，人群可分为高分泌组(﹥300 ng·ml-1)和低分泌组(﹤300 ng/ml)[9]，一般而言，具有HLAA9、HLAA23、HLAA24、HLAA29、HLAA33的个体sHLAⅠ类抗原水平较高，而具有HLAB37、HLAB27的个体sHLAⅠ类抗原水平较低。国内文献报道，广东、成都、上海地区健康人群血清sHLAⅠ类抗原水平分别为(699.54±360.10)ng·ml-1、(807.13±519.18) ng·ml-1、(529.32±282.88 )ng·ml-1[10-12]，同本次试验结果有一定的出入。究其原因，可能与个体HLAⅠ类抗原表型及种族差异、地区差异、试验试剂及实验条件等有关。因此各实验室应采用一致的试剂及操作方法，建立自己的正常值范围，而且一定要注意与正常值比较或动态观察其升降，只有这样测定的sHLAⅠ类抗原水平才具有临床意义。

【参考文献】
  　1 Van Rood JJ, Van Leeuwen A, Van Santen MC. AntiHLAA2 inhibitor in normal human serum[J]. Nature, 1970; 226(2): 366-367.

　　2 Haynes LD, Waldman WJ, Bushkin Y, et al. CMVinfected allogeneic endothelial cells initiate responder and bystander donor HLA class Ⅰ release via the metalloproteinase cleavage pathway[J]. Hum Immunol, 2005; 66(3): 211-221.

　　3 Irena A, Roger EK, Thomas P, et al. Soluble HLA: patterns of expression in normal subjects, autoimmune diseases, and transplant recipients[J]. Rheumatol Int, 2005; 25(3): 491-500.

　　4 Wolf RE, Adamashvili IM, Geled FB, et al. Soluble HLAⅠin rheumatic diseases[J]. Hum Immunol, 1998, 59(4): 644-649.

　　5 Contini P, Ghio M, Merlo A, et al. Soluble HLA classⅠ/CD8 ligation triggers apoptosis in EBVspecific CD8(+) cytotoxic T lymphocytes by Fas/ Fas ligand interaction[J]. Hum immunol, 2000, 61(10):1347-1351.

　　6 Contini P, Zocchi MR, Pierri I, et al. In vivo apoptosis of CD8(+) lymphocytes in acute myeloid leukemia patients: involvement of soluble HLAI and Fas ligand[J].Leukemia, 2007; 21(2): 253-260.

　　7 Shimur T, Hagihara M, Yamamoto K, et al. Quantification of serum soluble HLA class Ⅰantigens in patients with gastric cancer[J]. Hum Immunol, 1994; 40(1): 183-192.

　　8 Yang C W, Kim T G, Kim Y S, et al. Serum soluble HLA class Ⅰantigens levels in hemodialysis patients and following renal transplantation[J]. Am J Nephrol, 1995; 15(1): 290-294.

　　9 McDonald J, Gelder F, Aultman D, et al. HLA in human serumquantification of class Ⅰby enzyme immunoassay[J]. Transplantation, 1992; 53(2): 445-459.

　　10兰炯采，吴涛，周华友，等. 可溶性HLAⅠ检测技术和贮存血中可溶性HLAⅠ的浓度变化观察[J]. 中国实验血液学杂志，2004;12(3)：363-367.

　　11兰炯采，石宁，杨崇礼，等. 溶性HLAⅠ的检测监控及其对器官移植排斥反应的监控[J]. 中华医学检验杂志，1999;22(1)：33-35.

　　12裴斌，姚芳娟，杨珏琴，等. ELISA检测血中可溶性HLAⅠ类抗原[J]. 临床检验杂志，2001;19(4)：213-215.