作者：林玲 陈东林    作者单位：(四川大学华西药学院，四川 成都 610044)

【摘要】  目的：分离纯化鉴定毛果甘青乌头中的生物碱成分。方法：药材室温下自然烘干后，粉粹，用酸提碱沉法提取总生物碱，然后用硅胶柱层析法分离得到单体生物碱，利用化学法和光谱法鉴定其结构。结果：分离鉴定得到了10个化合物的结构，其中有六个内酯型C19二萜生物碱、四个C20二萜生物碱。结论：得到了10个纯的单体生物碱。

【关键词】  毛果甘青乌头;分离;内脂型C19二萜生物碱

乌头属(Aconitum)植物属于毛茛科(Ranunculaceae)，主要分布于北温带，全世界约350种，我国约170种[1]，是该属植物资源最丰富的国家[2],主要分布于西南各省。该属植物中,中国药典正式收录作为药用的有两种，川乌(附子)和草乌,但实际作为药用者约40种[3],具有镇痛，镇静，祛风湿，治疗跌打损伤，止咳，解热等功效。

　　二萜生物碱是该属植物的主要及特征性化学成分。由于其结构复杂，生理活性显著，因而引起了植物化学工作者极大的兴趣。自上个世纪70年代以来，随着分析技术，特别是核磁共振技术在结构分析鉴定中的广泛应用，二萜生物碱的化学研究也得到了迅速的发展。迄今为止，已对160多种乌头属植物进行了化学研究，所得到的成分多为C19二萜生物碱。二萜生物碱不仅是该属植物的有效成分和毒性成分,而且也被认为是植化分类上的特征性化学成分[4]。由于其结构复杂,生理活性显著,因而引起了植物化学工作者极大的兴趣。近30年来,由于波谱技术在结构解析中的广泛应用,二萜生物碱的研究得到了迅速的发展。迄今为止,临床药用的二萜生物碱有草乌甲素、高乌甲素和3乙酰乌头碱等。

　　1实验部分

　　1.1仪器、材料及试剂

　　红外光谱用NicoletFTIR 2005XV仪测定，KBr压片;质谱用VGAutospel 3000型和Finigan LCQ型质谱仪测定;核磁共振谱用BruderACE 200和Varian UNION 400/54 核磁共振仪测定，溶剂为CDCl3，TMS为内标;旋光用Perkin Polarimeter 341型旋光光度仪测定;熔点仪用WRXTS显示热差分析仪测定(未校正)。薄层层析所用吸附剂为硅胶G以5‰CMC水溶液或5‰NaOH，5‰CMC溶液调板，105℃活化1小时使用，用改良的Dragendorff’s试剂和20%的硫酸乙醇显色;常压柱层析所用硅胶均为青岛海洋化工厂制品(10-40μ)。氯仿为工业氯仿重蒸，石油醚，丙酮，甲醇均为分析纯，成都化学试剂厂生产。

　　原植物2008年8月采自西藏那曲，由西藏食品药品检验所格桑索朗副主任药师鉴定。

　　1.2总生物碱的提取

　　5公斤毛果甘青乌头全草粉末，采用0.05mol·L-1的盐酸75L进行渗漉至渗漉液无生物碱反应。将渗漉液用浓氨水碱化PH大于10，再用乙酸乙酯(30L)萃取3次。合并乙酸乙酯层，减压蒸馏，回收溶剂得总生物碱浸膏30.1克。

　　1.3单体生物碱的分离

　　总生物碱30克，以CHCl3溶解，溶于CHCl3的部分抽干得生物碱Ⅰ(18.7 g)，不溶于CHCl3的部分用甲醇溶解抽干得生物碱Ⅱ(12.0 g)。生物碱Ⅰ，以氯仿溶解，经胶柱层析(硅胶300g，环己烷-丙酮/5：1→1：1)梯度洗脱。洗脱液经TLC检查合并分为AD四个部分。

　　A部分 (3.1 g)经硅胶柱层析 (硅胶20g，环己烷-丙酮/5：1)洗脱得单体6benzoylheteratisine (15 mg)、A1和A2。A1经反复胶柱层析 (环己烷-丙酮4：1)洗脱得6acetylheteratisine (36 mg)，A2经胶柱层析 (环己烷-丙酮/5：1→3：1)梯度洗脱得6benzoylheteratisine (0.24 g) 和heteratisine (1.09 g)。

　　B部分 (2.9 g)经胶柱层析 (石油醚-乙酸乙酯/3：1→1.5：1)梯度洗脱得B1、B2 和B3。B1部分经胶柱层析先用 (环己烷-丙酮/3：1)为洗脱剂再用(氯仿-甲醇-二乙胺/99：1：1)为洗脱剂洗脱得dehydroheteratisine (0.82 g)。同样洗脱剂处理B2部分，得dehydroheteratisine (19 mg)。B3 经硅胶柱层析 (环己烷-丙酮/4：1)洗脱得dihydrogeyerine (10 mg)。

　　C部分 (2.6 g)经胶柱层析 (环己烷-丙酮/4：1→3：1)梯度洗脱得C1和C2。C1部分经胶柱层析 (环己烷-丙酮/5：1→3：1)梯度洗脱得tongolinine (27 mg)以及tongolinine和venulol 的混合物，经反复胶柱层析(环己烷-丙酮/4：1)得venulol (18 mg), C2部分经胶柱层析 (氯仿-甲醇-二乙胺/98：1：0.5)得heterophylline (11 mg),以及heterophylline和dihydrogeyerine混合物，经制备薄层层析得dihydrogeyerine (8 mg)。

　　D部分 (2.0 g)经反复胶柱层析(氯仿-甲醇/95：5)得heteratisine (14 mg) 和guanfu base Z (14 mg)。

　　生物碱Ⅱ (12.0 g)未分离得到单体生物碱。

　　1.4单体生物碱的结构测定

　　毛果甘青乌头(Aconitum tanguticum(Maxim.)Stapf var.trichocarpum Hand.-Mazz)是甘青乌头的一个变种，属于乌头属(Aconitum)植物[5-6]。对其化学成分的研究尚属于首次。从西藏那曲产的毛果甘青乌头中分得10个化合物。其中有六个内酯型C19二萜生物碱、以及四个C20二萜生物碱[7]，并应用IR、MS、HRMS、1HNMR、13CNMR、DEPT等光谱法和化学法鉴定了其化合物的结构为：6acetylheteratisine(1)[8], 6benzoylheteratisine(2)[8], dehydroheteratisine(3)[9], heteratisine(4)[8], heterophyllidine(5)[10], heterophylline(6)[10]，dihydrogeyerine(7)[11], guanfu base Z(8)[12], tongolinine(9)[13], and venulol(10)[14]。(见表1)

　　1.4.16acetylheteratisine(1)

　　白色无定形粉末; ESIMS m/z： 434[M+H]+，分子式为C24H35NO6; 1HNMR (400 MHz，CDCl3)， ??: 0.87 (3H, s, H318)，1.04 (3H, t, J = 7.2 Hz, NCH2CH3)，2.08 (3H, s, OAc), 3.15(1H, t， J = 9.6 Hz), 3.23 (1H, d， J = 8.2 Hz), 3.32 (3H, s, OCH3), 3.58 (1H, d， J = 3.6 Hz, H17) 3.82 (1H, d, J = 12.4 Hz ), 4.74 (1H, m), 5.32 (1H, d, J = 6.8 Hz), 13CNMR数据见表2。将该化合物的理化性质和波谱数据与文献[8]对照，可确定其结构。表1 甘青乌头中生物碱结构及分子式

　　白色无定形粉末，ESIMS m/z：496 [M+H]+，分子式为C29H37NO6; 1HNMR (400 MHz，CDCl3) ??: 0.92 (3H, s, H318)，1.07 (3H, t, J = 7.2 Hz, NCH2CH3)，3.29 (3H, s, OCH3)，3.48 (1H, q， J = 10.4 Hz)，7.48 (2H, t， J = 7.2 Hz，Bz), 7.56 (1H, m，Bz), 8.09 (2H, m， J = 4 Hz，Bz)13CNMR数据见表2。将该化合物的理化性质和波谱数据与文献[8]对照，可确定其结构。

　　1.4.3dehydroheteratisine(3)

　　白色无定形粉末; ESIMS m/z：390 [M+H]+，分子式为C22H31NO5;1HNMR (400 MHz，CDCl3)， ??: 0.93 (3H, s, H318)，1.08 (3H, t, J = 6.8 Hz, NCH2CH3)，3.18 (1H, d, J = 13.2 Hz), 3.32(3H, s, OCH3), 3.74 (1H, s, H17), 3.88 (1H, s), 4.78 (1H, t, J = 8 Hz),13CNMR数据见表2。将该化合物的理化性质和波谱数据与文献[9]对照，可确定其结构。

　　1.4.4heteratisine(4)

　　白色无定形粉末; ESIMS m/z：392 [M+H]+，分子式为C22H33NO5; 1HNMR (400 MHz，CDCl3)，: 0.98 (3H, s, H318)，1.04 (3H, t, J = 6.8 Hz, NCH2CH3)，3.14 (1H, t, J = 8 Hz), 3.27 (3H, s，OCH3), 3.50 (1H, s, H17), 4.01 (1H, d， J = 7.6 Hz, H9), 4.42 (1H, s)，4.50 (1H, m, H?6)， 4.75 (1H, m, H13)，4.82 (1H, s),13CNMR数据见表2。将该化合物的理化性质和波谱数据与文献[9]对照，可确定其结构。

　　1.4.5heterophyllidine(5)

　　白色无定形粉末; ESIMS m/z：378 [M+H]+，分子式为C21H31NO5;1HNMR (400 MHz，CDCl3)， ??: 1.05 (3H, s, H318)，1.08 (3H, t, J = 7.2 Hz, NCH2CH3)，3.39 (1H, d, J = 1.2 Hz，H17), 3.79(1H, br s，H9), 3.93 (1H, d，J = 7.2 Hz), 4.59 (1H, d， J = 7.6 Hz), 4.84 (1H, s, J = 7.2 Hz),13CNMR数据见表2。将该化合物的理化性质和波谱数据与文献[10]对照，可确定其结构。表2 化合物1-5的13C NMR数据 (100MH, CDCl3)

　　白色无定形粉末; ESIMS m/z：362 [M+H]+，分子式为C21H31NO4; 1HNMR (400 MHz，CDCl3)， ??: 0.92 (3H, s,H318)，1.13 (3H, t, J = 7.2 Hz, NCH2CH3)，3.30 (1H, d, w1/2=3Hz, H17), 3.82 (1H, d， J = 4 Hz, H9)，4.86 (1H, m, H13)， 13CNMR数据见表3。将该化合物的理化性质和波谱数据与文献[10]对照，可确定其结构。

　　1.4.7dihydrogeyerine(7)

　　白色无定形粉末; ESIMS m/z：430 [M+H]+，分子式为C25H35NO5;1HNMR (400 MHz，CDCl3)， ??: 0.91 (3H, t, J = 7 Hz, H4’)，1.19 (3H, d, J = 7 Hz, H5’)，1.35 (3H, s, H318)，1.38-1.58 (3H, m), 1.59 (1H, s), 1.99 (1H, s), 2.09 (1H, s), 2.93 (1H, br d,J = 15.3 Hz), 3.03 (1H, d， J = 11.9 Hz), 3.15 (1H, d， J = 11.9 Hz)，3.73 (1H, s)， 4.32 (1H, d,J = 9.0 Hz)，4.76 (1H, s), 4.95 (1H, s), 5.17 (1H, d， J = 9.9 Hz),13CNMR数据见表3。将该化合物的理化性质和波谱数据与文献[11]对照，可确定其结构。

　　1.4.8guanfu base Z(8)

　　白色无定形粉末; ESIMS m/z：416 [M+H]+，分子式为C24H33NO5;1HNMR (400 MHz，CDCl3)， ??: 1.07 (3H, s，H318)，1.99 (3H, d, J = 6.8, 1.6 Hz)，2.18 (3H, s)，2.71, 2.90 (each 1H, d， J = 12, 16 Hz，H219), 3.13 (1H, d， J = 2 Hz), 3.34 (1H, s), 3.50 (1H, s, H20), 3.80 (1H, s), 4.15 (1H, s), 4.26 (1H, d,J = 12.4 Hz, H11), 4.71, 4.91 (1H, s, H217)，5.19 (1H, br s),13CNMR数据见表3。将该化合物的理化性质和波谱数据与文献[12]对照，可确定其结构。

　　1.4.9tongolinine(9)

　　白色无定形粉末; ESIMS m/z：314 [M+H]+，分子式为C20H27NO2; 1HNMR (400 MHz，CDCl3)，1.05 (3H, s, H318)，3.54 (1H, t, J = 2.4 Hz,)，4.05 (1H, s), 4.89 (1H, d,J = 2.4 Hz), 4.97 (1H, dd,J = 2.4, 1.2 Hz, H17), 7.41 (1H, d,J = 2.8 Hz, H19),13CNMR数据见表3。将该化合物的理化性质和波谱数据与文献[13]对照，可确定其结构。表3 化合物6-10的13C NMR数据 (100MH, CDCl3)

　　白色无定形粉末; ESIMS m/z：314 [M+H]+，分子式为C20H27NO2; 1HNMR (400 MHz，CDCl3)，1.37 (3H, s, H318)，2.03 (1H, s), 2.07 (1H, s), 2.30 (1H, d, J = 4.5 Hz), 2.50 (1H, br d,J = 4.6 Hz), 3.97 (1H, d, J = 4.5 Hz,)，13CNMR数据见表3。将该化合物的理化性质和波谱数据与文献[14]对照，可确定其结构。

　　3讨论与结论

　　毛果甘青乌头为甘青乌头变种，属于藏药常用药，至今未见其成分研究的报道，本课题主要研究了其生物碱化学成分，从中分离鉴定得到了10个化合物的结构。其中有六个内酯型C19二萜生物碱、以及四个C20二萜生物碱，结构类型较为独特，丰富了植物分类学的内容。

　　我们也对已报道的化合物药理活性作了文献调研，发现其主要成分都含有强心和抗心率失常作用，但药理作用研究不全面，全草作为藏药主要用于散热，却未见对单体化合物此种功效的研究，文献研究为进一步研究未见报道的化合物的活性提供了方向，也为该药的临床运用提供了一定的科学依据。

【参考文献】
  　1 中国科学院植物志编辑委员会, 中国植物志[M]. 科学出版社, 1979, 27: 135-235.

　　2 陈迪华. 二萜类生物碱的生理活性及其药用前景[J]. 中草药, 1984,15 (4): 36-40.

　　3 肖培根. 中国毛茛科植物群的亲缘关系?化学成分和疗效间相关性的初步探索[J].植物分类学报, 1980, 18(2): 142-153.

　　4 丁立生, 陈维新, 天然产物研究与开发. 1989, 1:6-32.

　　5 Luo Y, Yang QE, Taxonomic revision of Aconitum (Ranunculaceae) from Sichuan, China[J]. Acta Phytotaxonomica Sinica, 2005, 43(5): 289-386.

　　6 中国科学院中国植物志编委会,中国植物志[M]. 科学出版社,1979, 27:184.

　　7 Wang FP, Liang XT, In The Alkaloids: Chemistry and Biology; Cordell G.A., Ed.; Elesvier Science: New York, 2002; Vol. 59, Chapter 1, pp 1-280.

　　8 Desai HK, Pelletier SW, 13Cnmr assignments for lactonetype norditerpenoid alkaloids[J].. Journal of Natural Products, 1993, 56(15): 2193-2197.

　　9 Aneja R, Pelletier SW. The diterpene alkaloids: the pyrolysis and absolute configuration of heteratisine[J]. Tetrahedron Letters, 1965, 6(2): 215-223.

　　10Pelletier SW, Aneja R, The diterpene alkaloids: three new diterpene lactone alkaloids from aconitum heterophyllum wall[J]. Tetrahedron Letters, 1967, 8(4): 557-560.

　　11Grina JA, Schroeder DR, Wydallis ET, Stermitz FR, Alkaloids from delphinium geyeri. Three new C20diterpenoid alkaloids. Journal of Organic Chemistry, 1986, 51: 390-394.

　　12Manfred G, William WH, Chen DC, et al. A 2D NMR structure determination of Guanfu base Z, a new diterpene alkaloid from the Chinese herb Guanbaifutzu (Aconitum koreanum)[J]. Heterocycles, 1986,24(1):49-61.

　　13He L, Chen YZ, Ding LS, et al.New alkaloids tongoline and tongolinine from delphinium tongolense[J]. Chinese Chemical Letters, 1996,7(4): 557-560.

　　14Ulubelen A, Mericli AH, Mericli F,et al.Two C20 diterpenoid alkaloids from delphinium venulosum[J]. Phytochemistry, 1992,31(24):3239-3241.