作者：李蓉 刘明华 肖顺汉 谢伟蓉 曹阳 任美萍    作者单位：(泸州医学院药理毒理学研究室，四川 泸州646000)

【摘要】  目的：建立卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP，探讨马蔺子素对COC1/DDP的逆转作用。方法：采用逐步递增DDP浓度、体外间歇诱导法诱导卵巢癌细胞系COC1，建立卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP;以CCK8试剂盒(Cell Counting Kit8)检测马蔺子素对COC1/DDP细胞增殖的抑制作用; 以GSH和GSSG试剂盒检测细胞内GSH的水平;以高效液相色谱测定细胞内顺铂的含量。结果：历时5个月建立COC1/DDP，对顺铂耐药性稳定，耐药指数为9.44，对卡铂、长春新碱和阿霉素均有不同程度的交叉耐药性;马蔺子素对COC1/DDP的顺铂耐药性有逆转作用，逆转倍数达到3.44倍;与COC1比较，COC1/DDP细胞内GSH的水平增高，顺铂含量下降，但经马蔺子素干预后，COC1/DDP胞内的GSH的水平降低，顺铂的含量增加(P<0.01)。结论：马蔺子素对COC1/DDP有逆转作用，其机制可能与干预COC1/DDP细胞内GSH/GSTπ 解毒系统，增加细胞内顺铂的含量有关。

【关键词】  马蔺子素;COC1/DDP;顺铂;耐药性

卵巢癌是发生于卵巢组织的恶性肿瘤，占所有妇科恶性肿瘤的15%左右，具有起病隐匿、早期不易发现、易转移和预后差等特点，是死亡率最高的妇科肿瘤。进展期卵巢癌以化疗耐药和不良预后为特征，其五年生存率仅为25%～30%。铂类药物是目前临床上使用最广的抗癌药物之一，其代表药顺铂(cisplatin, DDP)以其广谱、高效的抗癌效应作为多种肿瘤的首选药物[1]，对卵巢癌、睾丸癌、头颈部癌及肺癌均有较高疗效，同时也是小细胞肺癌(SCLC)治疗的主要药物之一。但由于耐药性的产生使其不能发挥应有的作用，常导致化疗失败[2] 。因此，提高卵巢癌的化疗敏感性，降低化疗耐药尤其是对最常用的化疗药物顺铂的耐药性是改善临床预后的关键。马蔺子素(irisquinone)[3]由莺尾科埴物马蔺的种皮提取而得，其主要成分为马蔺子甲素，是一种新型醌类结构化合物。研究发现对肺癌、食道癌、头颈部癌、鼻咽癌、乳腺癌、宫颈癌等具有显著的放射增敏作用。本研究采用人卵巢癌细胞株COC1为诱导对象，采用逐步递增DDP浓度、间歇作用的体外诱导法，建立人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP，并研究马蔺子素对顺铂耐药性的逆转作用及其机制。

　　1 材料

　　1.1 试验药物 马蔺子素，为淡黄色粉末，购自山东新华制药股份有限公司。精确称取马蔺子素100mg，溶于10ml单RPMI1640培养液，以0.22 m超滤除菌器过滤除菌，制成10mg·mL-1的马蔺子素浓缩含药培养液。临用前用培养液稀释备用。

　　1.2 细胞株亲代卵巢癌细胞COC1来自分化差的人卵巢腺癌患者的癌性腹水，由中国医学科学院肿瘤所1993年建株，由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提供。

　　1.3 试剂顺铂注射液，云南个旧生物药业有限公司;RPMI1640，GIBCO公司;胰蛋白酶，美国Sigma公司;胎牛血清，天津灏洋生物制品科技责任有限公司;CCK8(Cell Counting Kit8)、GSH及GSSG试剂盒，碧云天生物技术研究所。

　　1.4 仪器酶标分析仪(型号：DNM9602型)，北京普朗集团;高效液相色谱仪(戴安P680型：P680A四元低压梯度泵，PDA100二极管阵列检测器，TCC100柱温箱，Chromeleon色谱工作站)，美国戴安公司;瑞士Precisa电子天平(型号：XR 205SMDR);台式高速离心机(型号：TGL16B)，上海安亭科学仪器厂;细胞培养箱(型号：MCO15AC)，日本三洋。

　　2 方法

　　2.1耐药细胞系耐药性的建立COC1细胞采用含10﹪胎牛血清的RPMI1640完全培养基，37℃、5%CO2条件下常规培养，细胞呈悬浮生长。待生长稳定后，取对数生长期COC1细胞培养在含DDP的RPMI1640培养液中，逐步提高DDP浓度间歇诱导，剂量为0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 μg·ml-1，最终获得一株能完全耐受1.0μg·ml-1 DDP的细胞株，细胞诱导成功后，将细胞在无药物的培养基中培养1个月，再进行各项实验。

　　2.2COC1/DDP对各种抗癌药的耐药指数 取对数生长期的COC1/DDP细胞制成细胞悬液，细胞浓度每毫升1×105/ml，接种于96孔板，每孔90μl，空白孔加入90μl RPMI1640，并加入倍比稀释成5种浓度的顺铂、卡铂、长春新碱、阿霉素四种抗癌药物，每一浓度重复3孔，阴性对照组加等体积无血清RPMI1640，并设空白对照组，置37℃，5%CO2孵箱内培养48h后每孔加入CCK8继续培养1h，酶标仪450nm波长下检测各孔吸光度A值，按下列公式计算抑制率：细胞增殖抑制率=[1-(A给药组-A空白孔)/(A阴性对照组-A空白孔)]×100﹪，LOGIT法计算各种抗癌药物的半数抑制浓度(IC50)及耐药指数(resistance index, RI), RI = IC50(耐药细胞)/ IC50(亲本细胞)。

　　2.3细胞生长曲线和群体倍增时间测定将5× 104·ml-1对数生长期单细胞悬液接种至24孔培养板中，37℃，5%CO2条件下培养。每日取3孔细胞进行计数，连续观察7日。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴绘制细胞生长曲线，并按Patterson公式计算群体倍增时间(doublingtime, TD )。TD = T× log2 / (logNt-logN0)(其中N0为初始细胞数，Nt为终末细胞数，T为Nt一N0时间)。

　　2.4马蔺子素对COC1/DDP顺铂耐药性的逆转作用

　　2.4.1最适逆转浓度的确定将不同浓度的马蔺子素加人96孔板，测定细胞存活率，确定马蔺子素对COC1/DDP的毒性作用，以COC1/DDP细胞存活率≥90%作为最适逆转浓度。

　　2.4.2 对COC1/DDP顺铂耐药性的逆转作用COC1/DDP细胞按每毫升1×105接种至96孔培养板，经24 h培养后，每孔加药10μl。对照组加入不同浓度DDP，逆转组加入马蔺子素最适逆转浓度和不同浓度DDP的混合液(对照组和逆转组DDP的终浓度分别为0.01，0.1，1，10，100 μg·ml-1)。阴性对照组每孔加入PBS10μl，并设空白对照。置37℃，5% CO2培养箱内培养48h后加入CCK8 10μl，继续培养1h，酶标仪450nm波长下检测各孔吸光度A450值，计算IC50及逆转倍数。

　　2.6细胞内GSH水平测定将COC1、COC1/DDP及经马蔺子素最适逆转浓度预处理12h的COC1/DDP细胞，按GSH和GSSG检测试剂盒说明书检测细胞内GSH的含量。

　　2.7高效液相色谱仪测定细胞内顺铂含量取COC1、COC1/DDP及经马蔺子素最适逆转浓度预处理12h的COC1/DDP细胞，在含有5μg·ml-1顺铂培养液中培养4h，用冷PBS洗2次，2700 r·min-1离心5 min，然后用高效液相色谱测定细胞内顺铂的含量(顺铂的浓度用测定每1×106个细胞中的顺铂量表示)。色谱条件为：氨基键合硅胶柱，样品溶剂为二甲基甲酰胺，流动相为乙酸乙酯∶甲醇∶二甲基甲酰胺∶水(25∶16∶5∶5)，检测波长为310nm,流速1.5 mL·min-1，进样量20μl。

　　2.8统计学方法结果用均数(标准差(x±s)表示，用SPSS13.0统计软件行单因素方差分析(组间比较用SNK法)，以α=0.05为检验水准。

　　3 结果

　　3.1COC1/DDP耐药细胞株的建立及多药耐药特征历时5个月获得了一株在1.0μg·ml-1 DDP作用下生长良好的耐药细胞株COC1/DDP，CCK8试剂盒检测表明COC1/DDP细胞对顺铂的IC50值为COC1细胞的9.44倍，并对卡铂、长春新碱和阿霉素的耐药性也提高了约2～5倍不等，见表1。表1 COC1和COC1/DDP细胞对化疗药物的IC50值注：与COC1细胞比较，*P<0.01

　　3.2 COC1和COC1/DDP细胞生长曲线和倍增时间COC1和COC1/DDP细胞的生长曲线见图1。COC1细胞的倍增时间为32.99(0.20 h，COC1/DDP细胞的倍增时间为40.15(0.54 h，耐药细胞的倍增时间延长1.22倍。

　　3.3马蔺子素对COC1/DDP顺铂耐药性的逆转作用 马蔺子素单独应用，低浓度对COC1/DDP几无明显毒性作用，在0.5mg·ml-1时对COC1/DDP细胞的抑制率为接近10%，因此将马蔺子素在0.5mg·ml-1设为该药物的最适逆转浓度。DDP单独作用于COC1/DDP细胞时IC50为9.63±0.24μg·ml-1，但当马蔺子素0.5mg·ml-1与不同浓度的DDP合用时DDP的IC50为3.80±0.15μg·ml-1，逆转倍数达到2.53倍，结果见表2。图1 COC1和COC1/DDP细胞的生长曲线表2 马蔺子素与DDP合用前后对COC1/DDP细胞抑制率的影响(x±s，%)

　　3.4细胞内GSH水平及顺铂含量的变化与COC1比较，COC1/DDP细胞内GSH的水平增高，顺铂含量下降，但经1mg·ml-1马蔺子素干预后，COC1/DDP胞内的GSH的水平降低，顺铂的含量增加(P<0.01)。结果见表3。表3 马蔺子素对细胞内GSH浓度及顺铂含量的影响

　　4 讨论

　　肿瘤的多药耐药性(MDR)是指肿瘤对一种抗肿瘤药物产生耐药性的同时，对结构和作用机制不同的其他抗肿瘤药物也产生交叉耐药性。多项研究表明[34]，细胞内谷胱甘肽(GSH)水平与MDR关系密切，GSH全称Lγ谷氨酰L半胱氨酸甘氨酸，是存在于生物细胞内最重要的巯基化合物，其主要特点是具有活性巯基和γ谷氨酰健，从而对抗正常肽酶活性。谷胱甘肽S转移酶π(glutathioneStransferaseπ, GSTπ)属机体Ⅱ相代谢酶中催化GSH与亲电子性物质发生结合的一类酶。在人体几乎所有组织内均可测得GSTπ的存在，不同来源的肿瘤细胞中均有较高表达，尤以恶性肿瘤为显著。Versantvoort CH等研究表明[45]，对铂类耐药的卵巢癌细胞系中常发现GSH，其含量增加与细胞对铂类的耐药程度相平行，顺铂耐药与胞浆中GSH水平的相关系数高达0.96。

　　马蔺子素[53]由莺尾科埴物马蔺Lris Lactea pall.Var. Chinensis(Fisch) Koidz.的种皮提取而得，其主要成分为马蔺子甲素(C24H38O3),是一种新型醌类结构化合物。目前已有其成品(安卡)投入临床使用，其Ⅱ、Ⅲ期临床研究充分证实，安卡对肺癌、食道癌、头颈部癌、鼻咽癌、乳腺癌、宫颈癌等具有显著的放射增敏作用。在本实验研究中，人耐药卵巢癌细胞模型COC1/DDP细胞不仅对顺铂的药物敏感性降低，而且对卡铂、长春新碱和阿霉素的药物敏感性也有一定程度的降低，说明COC1/DDP细胞具有多药耐药性。应用逆转剂马蔺子素对人卵巢癌细胞COC1/DDP的生长进行观察，其IC50值均有明显下降，说明马蔺子素对COC1/DDP细胞有明显的逆转作用。同时实验表明耐药细胞株COC1/DDP中GSH含量明显高于亲代细胞，加入马蔺子素后胞内GSH含量明显下降，顺铂的含量却明显增加(P<0.01)。据此我们推测，马蔺子素的逆转作用可能与影响COC1/DDP胞内GSH/GSTπ解毒系统有关，同时也进一步证实了GSH/GSTπ解毒系统在肿瘤多药耐药性和抗癌药物外排中的重要作用。

　　本研究初步证实了COC1/DDP顺铂耐药性产生的机制与GSH/GSTπ解毒系统活性增强，加速顺铂的外排密切相关，同时研究表明，马蔺子素能逆转COC1/DDP的顺铂耐药性，其机制可能与干预COC1/DDP细胞内GSH/GSTπ 解毒系统，增加细胞内顺铂的含量有关，揭示马蔺子素在化疗药物增敏上具有广阔的开发前景，但其逆转作用的分子机制尚不清楚，有待进一步探讨和研究。

【参考文献】
  　1 李以欣(译). 癌症化学治疗的首选药物[J]. 国外医学—合成药 生化药制剂分册.1998, 19(2): 89-101.

　　2 吴孟超. 原发性肝癌外科综合治疗的现状和展望[J]. 中华外科杂志, 2004, 42(1): 13-13.

　　3 李德华.一种新型肿瘤放射增敏药“安卡”(马蔺子素)[J]. 中国肿瘤临床, 1999, 26(2):153-154.

　　4 Cheng TC, M an orek G, Samlmi G, et et a1. Identification of genes whose expression is associated with cisplatin resistance in human ovarian carcinoma cells[J]. Cancer Chemother Pharmacol, 2006, 58(3): 384-395.

　　5 Versantvoort CH, Broxterman HJ, Bawj T, et a1. Regulation by glutathione of drug transport in mulfidrugresistant human lung turnout cell lines overexpressing multidrug resistanceassociated protein[J]. Br J Cancer, 1995, 72(1): 82-89.

　　6 李德华.一种新型肿瘤放射增敏药“安卡”(马蔺子素)[J]，中国肿瘤临床，1999，26(2)：153-154.