【摘要】  目的：探讨检测金属β内酰胺酶的可靠方法。方法:收集临床分离耐亚胺培南的铜绿假单胞菌8株及产IMP1金属β内酰胺酶标准株一株,分别采用纸片增效法和双纸片协同实验检测金属酶表型，比较其结果。结果和结论:纸片增效法容易出现假阳性结果，而纸片协同法是相对可靠的检测金属酶的方法。

【关键词】  铜绿假单胞菌;金属β内酰胺酶;耐药

碳氢霉烯类抗生素是治疗多重耐药铜绿假单胞菌所引起感染的最有效的抗生素，但金属β内酰胺酶(MBL)的产生对这类抗生素的使用造成严重威胁，因此，对MBL的检测具有重要的临床意义,而MBL的检测临床实验室标准化协会(CLSI)尚无推荐方法。我们收集了汕头大学第一附属医院临床分离的对亚胺培南(IMP)耐药的铜绿假单胞菌8株及产IMP1型MBL的标准株一株，分别采用纸片增效法和双纸片协同实验检测MBL表型，探讨检测铜绿假单胞菌MBL的方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 菌株随机收集汕头大学医学院第一附属医院2005年至2006年分离的对IMP耐药的铜绿假单胞菌8株，双纸片协同实验(2巯基丙酸作为抑制剂)和PCR方法检测证实均不产MBL。产IMP1型MBL的铜绿假单胞菌作为阳性对照株，由俞云松教授惠赠。

　　1.2 菌液制备细菌LB平板过夜培养，挑取数个菌落，生理盐水制成0.5麦氏单位菌液备用。

　　1.3 纸片法测定IMP的抑菌圈将菌液均匀涂布于MH平板上，贴上IMP纸片(每片30μg)，35℃培养18小时后测量抑菌圈。

　　1.4 纸片法测定EDTA的抑菌圈将菌液均匀涂布于MH平板上，贴上5 张空白灭菌纸片，在纸片上分别滴加浓度为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5M EDTA各10μl，35℃培养18小时后测量抑菌圈。

　　1.5纸片增效法检测MBL 将菌液均匀涂布于MH平板上，分别贴上5片亚胺培南纸片，在纸片上分别滴加浓度为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5M EDTA各10μl，35℃培养18小时后测量抑菌圈。

　　1.6 纸片协同法检测MBL 将菌液均匀涂布于MH平板上，贴上IMP纸片，在IMP纸片的旁边贴上1张空白灭菌纸片，两纸片距离分别为1.0、1.5、2.0、2.5cm，在空白纸片上滴加0.5M EDTA 10μl。经35 ℃18小时孵育后观察结果。

　　2 结果

　　2.1 纸片法及纸片增效法结果 IMP抑菌圈、不同浓度EDTA抑菌圈及纸片增效法所产生抑菌圈见表1。表1 纸片法及纸片增效法所产生的抑菌圈注：*不同浓度的EDTA(M)2.2 纸片协同法结果 当IMP纸片与EDTA纸片的距离为1.0cm时，IMP纸片位于EDTA的抑菌圈中，两者的抑菌圈相互融合，IMP1株可见协同效应，而1-9号菌株均未见协同效应;IMP纸片与EDTA纸片的距离为1.5 cm及2.0cm时, IMP1株可见协同抑菌圈，1-9号菌株未见协同抑菌圈;IMP纸片与EDTA纸片的距离为2.5cm时,IMP1株可见EDTA近IMP端抑菌圈扩大，IMP抑菌圈不变，两者未见协同抑菌圈，1-9号菌株未见协同抑菌圈。

　　3 讨论

　　铜绿假单胞菌常引发院内感染，由于其天然耐药及获得性耐药，临床治疗十分棘手。碳氢霉烯类抗生素是治疗多重耐药铜绿假单胞菌引起感染最有效的抗生素，但MBL的产生对其应用造成了严重威胁。对MBL表型的检测目前CLSI尚无推荐的方法，存在较多争议。MBL表型的检测一般利用金属酶的活性需要锌等二价离子,故应用金属离子螯合剂如EDTA、2MPA去除锌离子以灭活酶的活性, 由于2MPA有一定刺激性和毒性，而EDTA简单易得，故多采用EDTA作为抑制剂进行MBL表型的检测，方法上一般采用双纸片协同或纸片增效法。相比之下,纸片增效法更为简单易行，结果容易观察而被普遍采用。从结果可以看出，虽然0.1M 的EDTA对菌株无抑菌效果，但在纸片增效法中，IMP纸片滴加0.1M 的EDTA后，部分MBL阴性株的抑菌圈明显扩大，超过了5毫米(部分文献采用7毫米的标准)[1-2],而高浓度的EDTA本身就能产生抑菌圈，且不同菌株菌株产生的抑菌圈大小不一，部分菌株甚至相差很大，这说明，对MBL阴性株，EDTA可以降低其对亚胺培南的MIC从而产生假阳性结果，这也与文献报道相符合[3-4]。部分文献甚至采用滴加EDTA的抗生素纸片的抑菌圈较未滴加抗生素纸片抑菌圈扩大即判别为MBL阳性的标准，这势必会将大量MBL阴性株误判为阳性株。本实验中，纸片协同法能有效检出MBL，也未出现假阳性结果，是相对准确的方法。由于滴加EDTA(0.5M)的空白纸片本身能产生较大抑菌圈，因此，EDTA纸片与IMP纸片之间的距离对结果的判断尤为关键，距离过近，两者的抑菌圈相互重叠，可干扰了结果判读，距离过大，则无协同效果。文献多采用的距离在1.0-2.5cm之间[5-7]，从本实验结果看，1.0cm的距离过近，IMP纸片位于EDTA的抑菌圈中，不利于结果的观察，而2.5cm的距离则过远，协同效应不明显。因此，纸片协同法是检测MBL较为可靠的方法，而IMP纸片与EDTA纸片的距离以1.5-2.0cm较为合理。

【参考文献】
  　1 蒋燕群，朱文欣，王坚强，等.耐碳氢霉烯类铜绿假单胞菌耐药机制研究[J]. 中国感染与化疗杂志, 2007, 7(1): 31-33.

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　　3 3. Perron K, Caille O, Rossier C, et al. CZCRCZCS: A two component system involved in heavy metal and carbapenem resistance in pseudomonas aeruginosa[J]. J Biol Chem, 2004, 279(10): 8761-8768.

　　4 Conejo MC, Isabel G, Luis MM, et al. Zinc eluted from siliconized latex urinary catheters decreases OprD expression, causing carbapenem resistance in pseudomonas aeruginosa[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2003, 47(7): 2313-2319.

　　5 鲍连生, 张多, 张振, 等. 儿童感染产金属β内酰胺酶铜绿假单胞菌耐药分析[J]. 中国医院药学杂志, 2008, 28(6): 472-474.

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