【摘要】  目的：探讨呼吸道上皮细胞与呼吸道致病菌之间的相互关系，观察呼吸道上皮细胞对绿脓杆菌的抗菌作用。方法：(1)贴壁生长的人呼吸道上皮细胞株HBE16与绿脓杆菌标准株ATCC27853共孵育，庆大霉素杀死胞外菌，动态观察上皮细胞内活细菌数;(2)HBE16细胞与绿脓杆菌共同悬浮于细胞培养基，在不同孵育时间点用平板菌落计数法计数活菌数。结果：绿脓杆菌不能在HBE16细胞内生长，并被细胞逐渐清楚。悬浮状态下的HBE16细胞对绿脓杆菌有一定杀菌作用。结论：呼吸道上皮细胞对胞内外绿脓杆菌的抗菌作用，可能是呼吸道抵抗细菌感染的一种天然免疫防御机制。

【关键词】  呼吸道上皮细胞;绿脓杆菌;抗菌作用

机体在生物进化过程中，为抵抗微生物的侵袭，发展出各种抗感染防御机制。机体的免疫系统分为天然免疫和获得性免疫，他们共同作用，使机体在复杂的外环境中，维持正常的生命过程。在发生学上最古老的防御机制是天然免疫，其在对抗病原微生物的感染过程中所发挥的作用越来越引起人们的注意[1]。

　　上皮细胞是天然免疫的重要组成部分，构成机体抵御外来病原微生物的首要防线。研究显示泌尿道、消化道及口腔上皮细胞对细菌有直接抗菌作用[2-3]。呼吸道上皮细胞是呼吸道防御微生物感染的第一道屏障，绿脓杆菌在自然界中广泛存在，是肺囊性纤维化病人和医院内感染最常见的条件致病菌之一[4-6]。绿脓杆菌对正常人不致病，只在免疫功能低下或粘膜上皮细胞受损和功能失常的时候才引起感染[7]。呼吸道上皮细胞在防御这类机会致病菌感染时可能发挥了重要的作用。为了了解呼吸道上皮细胞与绿脓杆菌之间的相互关系，本实验观察呼吸道上皮细胞对绿脓杆菌的抗菌作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　绿脓杆菌标准株ATCC27853株、人呼吸道上皮细胞株HBE16为本实验室保存。酵母提取物、胰蛋白胨、琼脂粉为OXOID公司产品。DMEM培养基、非必需氨基酸购自GIBCO公司，新生牛血清购自Hyclon公司，TritonX100购自Sigma，其余试剂为国产分析纯。

　　1.2 细菌的准备

　　从LB平板中挑取单个菌落接种于5mlLB液体培养基中，150转/分振荡培养3-5h，取100μl菌液涂布接种于固体LB培养板上。倒置于37°C孵箱培养，16h后收集活菌。用PBS洗涤细菌三次，紫外分光光度计测定650nmOD值，确定细菌的浓度(绿脓杆菌OD650=1.3相当于每mL细菌量109)。

　　1.3 细胞的准备

　　HBE16细胞用含10%新生牛血清的DMEM培养基(无抗生素)，37°C，5%CO2孵箱常规培养。待细胞进入快速生长期，PBS洗涤，胰酶消化，收集并计数确定细胞数量。将HBE16细胞以8×104/孔接种于48孔板，经48小时生长细胞汇合后(细胞数大约为1.2×105/孔)进行实验。

　　1.4 单层贴壁HBE16细胞对胞内绿脓杆菌生长的影响

　　HBE16细胞用PBS洗三次，每孔加入200μl DMEM培养基稀释好的ATCC2785细菌(细菌与细胞的数量比分别是10:1，20:1，50:1)，每个实验组做3复孔。放入37°C，5%CO2孵箱孵育两小时。用PBS洗细胞三次，每孔加入含庆大霉素(100μg·mL-1)及10%新生牛血清的DMEM培养基500μl，37°C，5%CO2孵箱孵育两小时以杀死细胞外的绿脓杆菌(庆大霉素不进入细胞内，只杀死胞外的细菌)。分别于实验的4小时、24小时用TritonX100裂解细胞，释放出细胞内的活细菌，用平板菌落计数法计算胞内活菌数。

　　实验重复3 次,数验数据以SPSS13.0进行统计学处理，数据以x±s表示，采用t检验。

　　1.5 悬浮状态HBE16细胞对绿脓杆菌的抗菌实验

　　HBE16细胞用含10%新生牛血清的DMEM培养基(无抗生素)，37°C，5%CO2常规培养。待细胞进入快速生长期，PBS洗涤，胰酶消化，收集并计数确定细胞数量。

　　细菌与细胞数按10：1的比例混合，加入EP管(体积为200μl)，细胞的终浓度为1×105个/ml，细菌的终浓度为1×106个/ml。实验分二组：对照组只加细菌;实验组加入细胞和细菌，试验采用三复管。放入37℃，5%CO2的细胞培养箱，分别于孵育后的15min、30min、60min、90min、120min，加入200μl 浓度为0.25%的Tritonx100，放置15 min，作10倍系列稀释,每个稀释度取100ul 样品涂布于LB 琼脂平板, 37 ℃温箱培养,菌落计数。

　　实验重复3 次,实验数据以SPSS13.0进行统计学处理，数据以x±s表示，采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 绿脓杆菌在贴壁生长HBE16细胞内的存活情况

　　HBE16细胞与绿脓杆菌共孵育(细菌与细胞数比值分别为10：1，20：1，50：1)，以庆大霉素杀灭细胞外的细菌，分别于实验4h、24h计数胞内活菌，结果显示实验24h胞内活菌比实验4h减少了95%，提示绿脓杆菌ATCC27853在HBE16细胞内不仅没有生长，而是被细胞大量杀灭(图1)。图1 贴壁生长HBE16细胞对胞内绿脓杆菌的抗菌活性

　　2.2 悬浮状态下HBE16细胞对绿脓杆菌的抗菌活性

　　悬浮的HBE16与ATCC27853按10：1的比例共孵育，分别于实验15min、30min、60min、90min、120min取样，菌落计数法计数活菌。实验结果表明，从30min开始，实验组细菌数与无细胞的对照组相比，活菌数量减少，两组最大差别出现在实验60min，实验组活菌数比对照减少32%;在实验120min，实验组细菌数与对照组相比，仍减少20%(图2)。图2 悬浮状态下HBE16细胞对绿脓杆菌的抗菌活性

　　本实验还观察了在悬浮状态下细菌与上皮细胞共同孵育后，以庆大霉素杀死胞外菌，裂解上皮细胞检测细胞内可能存在的活菌，结果显示细胞在悬浮状态下，细菌不能够进入细胞，因此悬浮状态下细胞抗菌活性不涉及上皮细胞内吞细菌，而只需要细菌与细胞密切接触(或粘附)。

　　3 讨论

　　传统的观念认为吞噬细胞(中性粒细胞、单核/巨噬细胞)是机体吞噬和杀灭致病菌的主要细胞，而上皮细胞扮演机械屏障的角色阻挡微生物的侵袭。近年不断有文献提示上皮细胞同样具备重要的抗菌活性。实验发现以来自正常妇女儿童的尿路脱落上皮细胞与大肠杆菌悬浮混合，结果上皮细胞表现出明显抗菌活性，而反复尿路感染病人的上皮细胞对大肠杆菌抗菌活性却弱于正常人细胞[3]。来自正常人口腔上皮细胞与细菌共同孵育表现类似抗菌活性，而白塞氏病病人口腔上皮细胞抗菌活性减弱。另外也有实验观察到肠道上皮细胞对某些细菌直接的杀菌现象。

　　呼吸道有着机体最大的粘膜表面，正常人下呼吸道能够维持无菌，上呼吸道虽然有细菌常驻，但是并不引起感染，显然机体有效控制了细菌的数量和蔓延。呼吸道抗感染防御机理长期以来就是医学研究的重要课题，并取得长促进展，呼吸道粘膜上皮细胞表面的纤毛运动，上皮细胞合成各种杀菌活性物质，肺泡巨噬细胞等，都是构成呼吸道天然免疫防御的重要因素。呼吸道上皮细胞与细菌的相互关系，是我们了解机体抗感染机制的重要内容。在本研究中我们观察了进入呼吸道上皮细胞HBE16的绿脓杆菌随着时间推移的数量变化，结果显示绿脓杆菌难以在细胞内生长，并很快被细胞清除，这与我们前期采用A549细胞株获得的结果，以及其他学者文献报道相似，反映出呼吸道常驻菌即使进入上皮细胞，也难以借此通道向粘膜下侵袭，上皮细胞主动吞噬细菌，可能是呼吸道上皮细胞控制感染的一种机制。悬浮状态下的呼吸道上皮细胞是否表现抗菌能力，目前还未见报道，本实验首次观察了这一现象，结果发现悬浮状态下的呼吸道上皮细胞与绿脓杆菌共孵育，绿脓杆菌活菌数量明显低于对照，由于悬浮状态下细菌并不进入细胞，因此这一现象显示细胞通过与细菌密切接触同样发挥抗菌作用，上皮细胞可能以此控制细菌过度生长。本文观察的两种抗菌现象其分子机理值得探讨。总之，深入了解呼吸道上皮细胞与微生物之间的复杂关系，将有助于我们更好的预防和治疗感染性疾病。

【参考文献】
  　　1 Medzhitov R, Janeway Jr. An ancient system of host defense[J]. Current Opinion Immunology, 1998, 10(1): 12-15.

　　2 Kazmierczak BI,Mostov K, Engel JN. Epithelial cell polarity alters RhoGTPase responses to Pseudomonas aeruginosa[J]. Mol Biol Cell, 2004, 15(2): 411-419.

　　3Schofer O, Ludwig K, Mannhardt W, et al. Antibacterial capacity of buccal epithelial cells from healthy donors and children with recurrent urinary tract infections[J]. Eur J Pediatr, 1988, 147(1): 229-232.

　　4Plotkowski MC, Costa AO, Morandi V, et al. Role of heparin sulphate proteoglycans as potential receptors for nonpiliated Pseudomonas aeruginosa adherence to nonpolarised airway epithelial cells[J]. J Med Microbiol, 2001, 50(1): 183-190.

　　5Noawens AS, Beatson SA, Whitch CB, et al. Proteome analysis of extracelllar proteins regulated by the las and rhl quorum sensing systems in Pseudomonas aeruginosa PAO[J]. Microbiology, 2003, 149(8): 1311-1322.