作者：赵 茉1,高 莉2,彭晓明2,祝建波1,闫 明2    作者单位：(1.石河子大学生命科学学院,新疆 石河子 832000;2.新疆维吾尔医药研究所,新疆 乌鲁木齐 830049)

【摘要】  目的 探讨黄连提取物对角质形成细胞株HaCaT增殖的影响及其机制。方法 将不同浓度的黄连提取物作用于培养的HaCaT细胞,采用台盼蓝染色法检测细胞活力;光镜观察细胞的形态变化;MTT比色法测定药物对细胞增殖的影响;RT-PCR半定量检测角蛋白K6和原癌基因Bcl-2的mRNA表达水平变化。结果 不同浓度(10.46～167.3 ?g/mL)黄连提取物处理HaCaT细胞24～72 h后,细胞增殖受到明显抑制,抑制率最高达75.5%,且呈现一定的浓度依赖性和时间依赖性。黄连提取物可以下调HaCaT细胞内的角蛋白K6和Bcl-2 mRNA转录水平,随着浓度的增高,诱导其表达水平降低的趋势越明显,呈现一定的浓度依赖性。结论 黄连提取物可以明显抑制HaCaT细胞的增殖,其机制可能与下调角蛋白K6和原癌基因Bcl-2的表达有关。

【关键词】  黄连;HaCaT细胞;角蛋白K6;Bcl-2

　Effect of Coptis Chinensis Extract on Proliferation of Keratinocytes ZHAO Mo1, GAO Li2, PENG Xiao-ming2, et al (1.Life Science College of Shihezi University, Shihezi 832000, China;2.Xinjiang Institute of Traditional Uighur Medicine, Urumqi 830049, China)

　　Abstract：Objective To study the effects of Coptis Chinensis extract on the proliferation of HaCaT cells and related mechanisms. Methods Cultured HaCaT cells were treated with different concentrations of Coptis Chinensis extract, and cell viability was detected by Trypan staining. Cell morphology changes were observed under optical microscopy. HaCaT cells poliferation were deteced by MTT assay. The mRNA expression changes of keratin 6 and Bcl-2 were separately detected by semi-quantitative reverse transcription PCR. Results After incubation with different concentrations (10.46～167.3 ?g/mL) of Coptis Chinensis extract for 24 to 72 h, HaCaT cells were inhibited dramatically and the highest inhibition rate was 75.5%. The mRNA expession of keratin 6 and Bcl-2 was down-regulated and its effect was exerted in a dose-dependent manner. Conclusions Extract of Coptis Chinensis can inhibit the proliferation of HaCaT cell. It might be related to the down-regulation of keratin 6 and Bcl-2 expression.

　　Key words：Coptis Chinensis;HaCaT;keratin 6;Bcl-2

　　黄连(Coptis Chinensis)具有清热解毒的功效。研究表明,黄连对癌细胞增殖有明显的抑制作用[1],而对角质形成细胞的增殖的影响鲜见报道。银屑病是一种常见的慢性、炎症性皮肤病,临床上一个主要病理特征是表皮细胞高度增殖[2]。本研究以角质形成细胞HaCaT细胞为研究对象,观察黄连提取物对HaCaT细胞的影响,为黄连临床治疗银屑病提供实验依据。

　　1 实验材料

　　1.1 药物与试剂

　　黄连购自新疆华康制药厂;人永生化角质形成细胞株HaCaT购自中国典型培养物保藏中心;高糖DMEM(GIBICO);胎牛血清(FBS,杭州四季青);TRIpure LS Reagent(购自北京百泰克);TIANScript RT Kit(购自天根生化科技);PCR Master MIX(购自天根生化科技);Taq酶(购自天根生化科技);角蛋白K6、原癌基因Bcl-2及内参GAPDH引物由上海生工合成。

　　1.2 仪器

　　Gene Amp PCR仪(美国PE公司),Tannon 3500R凝胶成像系统(天能公司),CO2培养箱(SANYAO),倒置显微镜(上海光学六厂37XB),RNA/DNA检测仪(Pharmacia Biotech),BIO-RAD550型酶标仪。

　　2 实验方法

　　2.1 受试药物制备

　　精密称取黄连粉末30 g(过20目),加8倍量80%乙醇加热回流提取3次,每次2 h,3次滤液合并,滤液减压浓缩为干浸膏。取0.1 g干浸膏溶于0.6 mL DMSO中(相当于原药材浓度为669.3 mg/mL)。临用前用DMEM培养基将药液稀释为669.3、502.0、334.7、167.3、83.66、41.83、20.92、10.46 ?g/mL (DMSO<0.1%)。

　　2.2 HaCaT细胞的培养

　　HaCaT细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液(含100万U/L青、链霉素)于37 ℃、5%CO2饱和湿度下贴壁培养,2 d换液1次,待细胞长成致密单层后,以0.25%胰蛋白酶进行消化传代培养。

　　2.3 台盼蓝染色法检测HaCaT细胞活力

　　HaCaT细胞以1×104个/mL的细胞悬液,接种于25 mL培养瓶中,阴性对照、各浓度组分别设3个重复,每瓶4 mL,置37 ℃、5%CO2孵箱培养。培养24 h后,吸弃各瓶培养液,加入不含药物及含有相应浓度药物的新鲜培养液。培养48 h后,消化细胞,进行台盼蓝染色,倒置显微镜下观察,血球计数板计数。细胞活力=(总细胞数-不排斥染料的蓝色细胞个数)/总细胞数×100%。连续计数3次,取其平均值,实验重复3次。

　　2.4 倒置显微镜观察HaCaT细胞形态

　　HaCaT细胞以1×104个/mL,2 mL接种于6孔培养板上,培养24 h后,吸弃各孔培养液,加入不含药物及含有相应浓度药物的新鲜培养液。培养48 h后,镜下观察细胞的形态并拍照。

　　2.5 MTT法检测HaCaT细胞增殖

　　HaCaT细胞以1×104个/孔的密度接种于96孔板中,培养24 h后,吸弃各孔培养液,加入新配制的不同浓度的药液,不加药液的细胞培养液作为阴性对照组,并以不含细胞的培养基作为空白对照用于仪器调零。分别在加药培养24、48、72 h后,每孔加入20 ?L MTT(5 g/L),继续孵育4 h,吸弃上清液,加入150 ?L DMSO,振荡10 min后,于酶标仪上测定490 nm波长处的吸光度值,计算生长抑制率及半数抑制浓度(IC50)值,每组重复5孔,进行3批实验。

　　2.6 RT-PCR法检测角蛋白K6、Bcl-2基因表达水平

　　2.6.1 细胞总RNA的提取 HaCaT细胞以2 mL(1×104个/mL)接种于6孔培养板上,细胞长至60%～70%融合时,吸弃旧的培养液,加入不同浓度的药液(10.46、20.92、41.83 ?g/mL)以及不含药液的细胞培养液。培养24 h后,严格按照TRIpure LS Reagent说明书进行细胞总RNA的提取,-20 ℃保存备用。每组重复3孔,实验重复3次。测定260 nm和280 nm的吸光度值,计算RNA浓度并评估纯度,进一步通过1%琼脂糖凝胶电泳分析。

　　2.6.2 反转录反应 参照TIANScript RT Kit说明书进行。根据紫外分光光度法测定的RNA浓度,调节反转录反应体系中RNA和ddH2O的加入量,使得每个反应体系的RNA浓度保持一致,RNA浓度为2 ?g/?L。

　　2.6.3 PCR扩增 K6引物序列：上游5’-ACA TCA TGA TGT AAT CAC CAC-3’,下游5’-ATA CAG GCT TTG TAC ATC ATA -3’扩增片段长度为270 bp。Bcl-2引物序列：上游5’-CTC GTC GCT ACC GTC GTG ACT TCG-3’,下游5’-CAG ATG CCG GTT CAG GTA CTC AGT C-3’,扩增片段长度为240 bp。内参GAPDH引物序列：上游5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’,下游5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’,扩增片段长度458 bp。基因K6,Bcl-2及内参GAPDH的PCR扩增条件均为94 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,25个循环,72 ℃延伸7 min。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物,凝胶分析软件进行条带灰度值分析。

　　3 统计学方法

　　所有数据用—(—数)±s表示,使用PEMS3.1统计软件,给药组与对照组比较采用t检验。

　　4 结果

　　4.1 黄连提取物对细胞活力的影响

　　台盼蓝染色结果显示,随着药液浓度的增高,HaCaT细胞的存活率从(95.23±2.18)%逐渐降低到(9.46±1.58)%。当药液浓度达到334.7、502.0和669.3 ?g/mL时,细胞的存活率分别达到(43.57±2.34)%、(21.8±1.76)%和(9.46±1.58)%,显著低于对照(95.23±2.18)%(P<0.01),当浓度达到167.3 ?g/mL时,细胞存活率可以达到(64.13±1.68)%,所以后续的实验药物浓度为167.3 ?g/mL以下。

　　4.2 黄连提取物对细胞形态学的影响

　　不同浓度药液作用于HaCaT细胞48 h后,随着药物浓度的升高,细胞融合度逐渐降低。从图1可以明显看出：对照组HaCaT细胞为多角形,呈铺路状镶嵌排列。细胞间连接非常紧密,边缘整齐,细胞界限渐不清楚。给药组HaCaT细胞随着药液浓度的增大(10.46～167.3 ?g/mL),细胞间的连接变得松散,单位面积上的细胞数目减少,边缘逐渐变得粗糙。结果表明,黄连对细胞增殖有不同程度的抑制作用。

　　A B C

　　D E F

　　注：A.对照组;B.给药组(10.46 ?g/mL);C. 给药组(20.92 ?g/mL);D. 给药组(41.83 ?g/mL);E. 给药组(83.66 ?g/mL);F. 给药组(167.3 ?g/mL)

　　图1 不同浓度黄连提取物处理后细胞形态的变化(48 h)

　　4.3 黄连提取物对细胞增殖的影响

　　经不同浓度药液处理后,细胞增殖受到明显的抑制作用。药液浓度为41.83、83.66、167.3 ?g/mL时,细胞抑制率分别为(21.3±2.11)%、(41.1±1.02)%、(74.1±1.19)%,与对照组相比,差异均有统计学意义。当药液浓度为167.3 ?g/mL时,处理24、48、72 h时,细胞抑制率可以达到(54.6±2.3)%、(74.1±1.19)%、(75.5±1.19)%;处理24、48、72 h时,对细胞增殖抑制作用的半数抑制浓度(IC50)分别为111.2、83.6、73.0 ?g/mL。可以看出,随着药液浓度的增大,时间的延长,这种抑制效应表现出明显的增强趋势,具有浓度依赖性与时间依赖性。

　　4.4 黄连提取物对角蛋白K6、Bcl-2基因转录水平的影响

　　4.4.1 总RNA纯度及质量鉴定 各组提取的RNA样品经RNA/DNA检测仪测定,A260/A280比值在1.7～1.9之间,1%琼脂糖凝胶电泳结果可见18S和28S条带,提示RNA质量良好,满足实验的要求。结果见图2。

　　图2 HaCaT细胞总RNA部分电泳图

　　4.4.2 角蛋白K6 mRNA和Bcl-2 mRNA转录水平的变化 经10.46、20.92、41.83 ?g/mL的药液处理细胞24 h后,角蛋白K6基因相对表达量以K6与GAPDH灰度比值表示,分别为(101.6±1.19)%、(68.1±1.23)%、(59.9±0.81)%,与对照组(118.3±2.12)%比较,差异均有统计学意义(P<0.01),角蛋白K6基因表达量随着药液浓度的增大而降低,呈现一定的浓度依赖性;Bcl-2基因的灰度比值分别为(75.3±1.67)%、(74.9±2.04)%、(67±1.89)%,与对照组(81.0±1.9)%比较,差异均有统计学意义(P<0.01),提示黄连提取物在一定浓度范围内可抑制Bcl-2基因的表达。其相应电泳图见图3～图5。

　　5 讨论

　　银屑病的发病机制非常复杂,至今尚未完全阐明。目前的观点认为银屑病是多基因遗传背景下,涉及到自身免疫、感染、微血管异常、神经精神等多种因素,通过多种途径引起的表皮角质形成细胞过度增生、凋亡异常、角化不全以及炎症反应[3-4]。角蛋白K6作为表皮细胞增殖的特异性标记蛋白,在表皮基底层上方的细胞中表达,在银屑病角质形成细胞增殖的实验研究中,银屑病皮损内角蛋白K6表达增加[5],而使用维生素A类药物作用于培养的银屑病角质形成细胞其表达水平下调[6]。本实验结果表明,黄连提取物在10.46～167.3 ?g/mL浓度范围内,能够显著抑制HaCaT细胞的增殖,且随着浓度的增加、作用时间的延长,这种效应有增强的趋势,呈现出一定的浓度和时间依赖性;黄连提取物在10.46～41.83 ?g/mL浓度范围内可以下调角蛋白K6 mRNA的表达,且呈现一定的浓度依赖性。结果提示,黄连提取物抑制HaCaT细胞增殖的机制之一,可能是通过抑制细胞中角蛋白K6基因的表达,使细胞增殖减慢。

　　细胞增殖与凋亡有着密不可分的关系,银屑病中角质形成细胞的凋亡异常可导致表皮增生过度,其病损处皮肤细胞维持这一种病理性的动态平衡。角质形成细胞的凋亡受到许多基因的控制,主要有Fas、Bcl-2家族、P53基因等。原癌基因Bcl-2家族成员中Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w具有抑制凋亡作用,而Bax、Bik、Bad和Bcl-xs具有促进凋亡作用,它们之间的平衡被认为是决定细胞凋亡的关键点。Tomkov等[7]发现,在银屑病皮损中,原癌基因Bcl-2等有不同程度的表达增加,对角质形成细胞的凋亡有一定的抑制作用。本研究结果显示,黄连提取物在10.46～41.83 ?g/mL时,Bcl-2 mRNA的转录水平随着药物浓度的升高而降低,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),呈现一定的浓度依赖性。提示黄连可能通过降低Bcl-2基因的表达,促使角质形成细胞的凋亡。

　　综上所述,黄连治疗银屑病的作用机制可能与其降低角蛋白K6及原癌基因Bcl-2的表达有关。本研究为黄连临床治疗银屑病提供了重要的实验依据。

【参考文献】
  　[1] 谭宇蕙,陈蔚文,李燕红,等.连黛片药物血清对人胃癌细胞株MGC803的作用[J].广州中医药大学学报,2001,18(1)：67-70.

　　[2] Bos JD, Menno A, De R, et al. The athogenesis of psorioasis：immunological facts and speculations[J]. Immunol Today,1999, 20(1)：40-46.

　　[3] Granen NM, Jackson CW, Kirby B, et al. Cytokine gene polymorphisms in psoriasis[J]. Br J Demratol,2001,144：849-853.

　　[4] Wilsmanm TD, Martin S, Reber M, et al. Biologicals dramatic advances in the treatment of psoriasis[J]. Currpharm Des,2006, 12(8)：989-999.

　　[5] Morrers JM, Van Rossum MM, Van Erp PE, et al. Changes in keratin 6 and keratin 10 (co-) expression in lesional and symptomless skin of spreading psorioasis[J]. Dermatology,2000,201(1)：15-20.

　　[6] Gilfix BM, Eckert RL. Co-ordinate control by vitamin A of keratin gene expression in human keratinocytes[J]. J Biol Chem,1985,260：14026-14029.

　　[7] Tomkov H, Fujimoto W, Arata J. Expression pattern of the bcl-2 homotogous protein bad in normal skin, psoriasis vulgaris and keratinocytic tumors[J]. J Struct Biol,2000,129(2/3)：278-287.