【摘要】  目的 探讨清热燥湿方对细菌脂多糖(LPS)诱导急性肺损伤(ALI)大鼠肺组织基质金属蛋白酶2(MMP-2)及其抑制因子(TIMP-2)基因表达的影响。方法 40只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组、LPS模型组、地塞米松组和清热燥湿方组,每组再分为4 h和8 h两个亚组。分别用地塞米松和清热燥湿方在LPS诱导ALI模型前预处理大鼠,分别采用免疫组化法和实时荧光定量PCR法检测大鼠肺组织MMP-2及TIMP-2 mRNA表达。结果 与模型组相比,4 h清热燥湿方组MMP-2 mRNA表达明显降低(P<0.01),TIMP-2蛋白染色阳性面积率及TIMP-2 mRNA表达均显著增高(P<0.01或P<0.05);8 h清热燥湿方组MMP-2蛋白染色阳性面积率及MMP-2 mRNA表达显著降低(P<0.01或P<0.05)。病理学观察显示,模型组大鼠肺组织出现大片出血及坏死,清热燥湿方组大鼠肺组织病理损伤程度较模型组减轻。结论 清热燥湿方能减轻LPS致ALI大鼠肺组织损伤,对LPS致ALI大鼠有保护作用。

【关键词】  清热燥湿方;急性肺损伤;细菌脂多糖;基质金属蛋白酶2;基质金属蛋白酶2抑制因子;大鼠

　Effects of Qingrezaoshi Decoction on the Expression of MMP-2, TIMP-2 and Their mRNA in ALI Rats Caused by LPS YANG Ai-dong, LI Wen-wen, WANG Dong-ying, et al (Shanghai University of TCM, Shanghai 201203, China)

　　Abstract：Objective To investigate the effects of Qingrezaoshi decoction on the expression of MMP-2 and their mRNA (MMP-2 mRNA), tissue inhibitor of MMP-2 and its mRNA (TIMP-2 mRNA) in the rats with acute lung injury (ALI) caused by LPS. Methods Forty male Wistar rats were randomly divided into 4 groups：normal control group, LPS model group, dexamethasone group and Qingrezaoshi decoction group. Each group had two subgroups, 4 h and 8 h after LPS injection. All rats, except normal control group, were administrated with LPS by intravenous injection to induce ALI. The rats in dexamethasone group and Qingrezaoshi decoction group were treated by dexamethasone (oral) and Qingrezaoshi decoction (oral) respectively before LPS-induced ALI. The expression of MMP-2 and TIMP-2 were measured by immunohistochemistry ABC, and their mRNAs were measured by real-time fluorescent PCR, while the histopathology of the lung injury was observed by light microscope. Results In 4 h Qingrezaoshi decoction group, the expression of MMP-2 mRNA was significantly decreased while the expression of TIMP-2 protein and its mRNA were significantly increased compared with model group (P<0.01 or P<0.05). In 8 h Qingrezaoshi decoction group, the expression of MMP-2 protein and its mRNA were significantly decreased (P<0.01 or P<0.05). Pathological observation showed that pulmonary hemorrhage and necrosis were largely seen in model group and a better condition in Qingrezaoshi decoction group. Conclusion Qingrezaoshi decoction may abate the histopathology of the lung injury and it has protective effects on endotoxin-induced ALI in rats.

　　Key words：Qingrezaoshi decoction;acute lung injury;lipopolysaccharide;MMP-2;TIMP-2;rats

　　在急性肺损伤(ALI)的发病过程中,细胞外基质(ECM)的降解是一个关键问题,许多蛋白酶参与了这一过程。研究表明,基质金属蛋白酶(MMPs),特别是MMP-2及其抑制因子(TIMPs)在实验性ALI和临床患者中起了重要作用[1]。因而研究MMPs及TIMPs对于防治ALI及急性呼吸窘迫综合征(ARDS)具有重要价值。先前的研究表明,清热燥湿方对内毒素休克肺有保护作用,其机制可能与其调控肺组织核子-κB p65 (NF-κB p65)蛋白表达有关[2]。在此基础上,本研究观察了清热燥湿方对ALI大鼠肺组织形态及肺组织MMP-2及TIMP-2 mRNA表达的影响,旨在寻求治疗ALI的有效方法并初步探讨其作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物

　　清洁级Wistar雄性大鼠40只,体重(220±20)g,上海中医药大学实验动物中心提供,合格证号：SCXK(沪)2007-005。

　　1.2 试剂及药物

　　大肠杆菌脂多糖(LPS O111B4)购自美国Sigma公司。大鼠MMP-2和TIMP-2免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。大鼠MMP-2、TIMP-2和GAPDH引物和探针序列由广州达辉生物技术有限公司合成。MMP-2上游引物：5’-CCC ATG AAG CCT TGT TTA CCA-3’,下游引物：5’-TGG AAG CGG AAC GGA AAC T-3’,探针序列：5’-TGGCAATGCTGATGGACAGCC–3’,5’端FAM修饰,3’端Tamra修饰;TIMP-2上游引物：5’-CTC ATC GCG GGC CGT TTA AG-3,下游引物：5’-GAA GGC TTC GGG TCA TCG AG -3’,探针序列：5’-CATGGAGAGCCTCTGTGGAT-3’,5’端FAM修饰,3’端Tamra修饰;GAPDH上游引物：5’-CCG AGG GCC CAC TAA AGG -3,下游引物：5’-GCT GTT GAA GTC ACA GGA GAC AA-3,探针序列：5’-CATCCTGGGCTACACTGAGGACCA-3,5’端FAM修饰,3’端Tamra修饰。Trizol总RNA提取试剂、反转录和PCR扩增所需的酶及其他试剂均购自美国Invitrogen公司。清热燥湿方由厚朴、草果、黄芩、柴胡等中药按一定比例组成,浓缩成1 g原药材/mL的水煎液,高温高压灭菌,4 ℃冷藏备用。中药饮片均购自上海曙光医院东院,地塞米松片购自上海医药有限公司信谊制药总厂。

　　1.3 分组、造模及给药

　　大鼠随机分为正常对照组(A组)、模型组(B组)、地塞米松组(C组)、清热燥湿方组(D组)。每组再分为4 h和8 h 2个亚组。除正常对照组外,其余各组大鼠均经尾静脉注射10 mg/kg的细菌脂多糖(LPS)复制ALI模型,其中C组、D组在造模前以相应药液灌胃3 d,2次/d,第3日灌胃后3 h,经尾静脉注入LPS(10 mg/kg)。A组和B组在相应的时间点给予等体积的蒸馏水,各组动物用药量按人与动物的体表面积换算,地塞米松灌胃量为0.45 mg/kg,清热燥湿方灌胃量为6.48 g原药材/kg。所有动物均于设定的相应时相点,用25%乌拉坦1.0 g/kg腹腔麻醉,开胸分离右肺上叶,10%甲醛溶液固定,用于病理检测及肺组织MMP-2和TIMP-2蛋白表达检测;右肺下叶置于液氮罐中作MMP-2 mRNA和TIMP-2 mRNA表达检测。

　　1.4 观察指标及检测方法

　　1.4.1 免疫组织化学ABC法检测 采用IMS细胞图像分析系统医学图像分析软件,对免疫组织化学结果进行图像采集和定量分析。每张切片在高倍镜下随机选择不相重叠的3个视野,细胞核为蓝色,MMP-2和TIMP-2阳性细胞为棕黄色。计算出每例样本的蛋白染色阳性面积率(蛋白染色阳性面积率=阳性细胞面积/总面积)作为比较参数。

　　1.4.2 实时荧光定量PCR检测 按Trizol法提取总RNA后,反转录合成cDNA,在20 ?L的反应体系中分别加入样本RNA 2 ?g,RT buffer(5×)4 ?L,10 mmol dNTPs 1 ?L,N9随机引物1 ?L,反转录酶MMLV 1 ?L,RNA酶抑制剂1 ?L,0.1 mol/L DTT 2 ?L,加DEPC处理水到20 ?L,混匀后于下列温度反应：37 ℃ 1 h, 95 ℃ 5 min,灭活MMLV,产物即为cDNA。PCR扩增：在50 ?L反应体系中加入cDNA 5 ?L,ddH2O水32 ?L,PCR buffer(5×) 10 ?L,荧光探针0.5 ?L,Taq DNA聚合酶1 ?L,dNTPs 0.5 ?L, MMP-2和TIMP-2上下游引物各0.5 ?L;扩增条件：①93 ℃,2 min。②93 ℃,45 s;55 ℃,1 min,10 Cycle。③93 ℃,30 s;55 ℃,

　　45 s,30 Cycle。扩增产物分析：数据采用仪器自带软件ABI Prism 7300 SDS Software分析。MMP-2 mRNA和TIMP-2 mRNA表达水平以其与GAPDH的相对表达量计算。

　　1.4.3 肺组织病理学观察 常规HE染色,光镜观察。

　　1.5 统计学方法

　　计量数据以—(—数)±s表示,组间差异采用SPSS13.0统计软件中ANOVA进行统计学分析,P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 大鼠肺组织基质金属蛋白酶2及其抑制因子蛋白表达(见表1)表1 各组大鼠肺组织MMP-2、TIMP-2蛋白染色阳性面积率比较(—(—染)±s)▲▲P<0.01;与C组比较,☆P<0.05(下同)

　　2.2 大鼠肺组织基质金属蛋白酶2及其抑制因子基因表达(见表2)　表2 各组大鼠肺组织MMP-2 mRNA、TIMP-2 mRNA表达比较(—(—比)±s,×10-4)

　　2.3 各组大鼠肺组织病理形态观察

　　光镜观察：A组大鼠肺泡结构清晰,肺泡壁薄,肺泡内未见水肿液,肺间质无炎细胞浸润。B组大鼠肺泡腔内充满炎性渗出物和出血,肺泡壁毛细血管扩张充血,细支气管黏膜上皮损伤部分脱落,管壁上大量淋巴细胞浸润,管壁增厚,可见肺不张、肺气肿。C组和D组局部肺泡壁毛细血管扩张充血,肺泡腔内见红细胞和少量渗出物。

　　3 讨论

　　MMPs是由许多主要降解ECM各种组分的酶构成的一个大家族,MMPs能特异性降解变性胶原、基底膜Ⅳ型胶原及弹性蛋白,它们通过破坏基底膜、促进炎症过程中有关细胞的迁移以及ECM重建,在ALI的发病过程中发挥重要作用。临床上在ARDS患者肺组织中同样发现了严重的基底膜破损[3],因而, MMPs的过度产生及活化使肺泡毛细血管屏障的通透性明显增加,从而引起肺水肿及严重的炎症反应。有研究表明,MMP-2和MMP-9通过降解基底膜的主要组分Ⅳ型胶原,从而在细胞周围基底膜转变及重塑中起重要作用[4]。

　　TIMPs是MMPs的主要内源性抑制因子,广泛分布于组织和体液中,共价结合MMPs而抑制其活性。研究表明,MMP-2和TIMP-2的相对浓度决定了MMP-2对胶原降解的能力。MMP-2表达和活性受TIMP-2影响,二者活性平衡对维持ECM稳态具有重要意义。MMPs和TIMPs的平衡被破坏时,肺泡上皮基底膜被破坏之后可导致肺泡上皮细胞受损,富含蛋白和蛋白酶的水肿液充满肺泡,使表面活性物质灭亡。此外,基底膜完整性受到破坏后,各种损伤因子易于进入肺间质和肺泡腔,加重肺间质和实质损伤,进而引起肺功能障碍,导致肺泡萎陷和顽固性低氧血症[5]。

　　本实验结果表明,模型组大鼠肺组织出现大片出血及坏死,提示造模成功。与正常组比较,模型组大鼠肺组织MMP-2蛋白及其mRNA明显升高,TIMP-2蛋白及其mRNA明显降低,提示ALI的病理变化与MMP-2和TIMP-2表达的平衡失调有关。用清热燥湿方预处理大鼠,能使LPS诱导的ALI肺组织水肿、出血等损伤程度明显减轻。与模型组相比,清热燥湿方组4 h MMP-2 mRNA表达明显降低(P<0.01),TIMP-2蛋白及其mRNA表达均显著增高(P<0.01或P<0.05);清热燥湿方组8 h MMP-2蛋白及其mRNA表达显著降低(P<0.01或P<0.05)。表明清热燥湿方对LPS致ALI大鼠有保护作用,其机理可能与其能降低LPS致ALI大鼠肺组织MMP-2蛋白(8 h)及其mRNA的表达和升高肺组织TIMP-2蛋白及其mRNA(4 h)的表达有关。

【参考文献】
  　[1] 杜 悦,蔡栩栩,吴玉斌,等.内毒素对新生大鼠肺组织金属基质蛋白酶2及其抑制因子2表达影响的研究[J].中国围产医学杂志,2004,7(6)：356.

　　[2] 杨爱东,屠燕捷,郭永洁,等.不同治法对内毒素性休克小鼠多器官功能障碍和肺NF-κB表达的影响[J].江苏中医药,2009,41(2)：71-72.

　　[3] Torii K, Iida K, M iyazaki Y, et a1. Higher concentrations of matrix metalloproteinases in bronchoalveolar lavage fluid of patients with adult respiratory distress syndrome[J]. Am J Respir Crit Care Med,1997,155(1)：43-46.

　　[4] Foda HD, Rollo EE, Drews M, et a1. Ventilator-induced lung injury upregulates and activates gelatinases and EMMPRIN：attenuation by the synthetic matrix metalloproteinase inhibitor, Prinomastat (AG3340)[J]. Am J Respir Cell Mol Biol,2001,25(6)：717-724.

　　[5] Ricou B, Nicod L, Lacraz S, et al. Matrix metalloproteinases and TIMP in acute respiratory distress syndrome[J]. Am J Respir Crit Care Med,1996,154(2 Pt 1)：346-352.