【摘要】  目的 明确抗肿瘤中药提取物蟾毒灵有无抗血管生成的活性,并检测其量效关系。方法 采用MTT法测定蟾毒灵对人脐静脉内皮细胞ECV304生长的抑制作用,计算IC50,观察其量效、时效关系;并以鸡胚绒毛尿囊膜为模型观察蟾毒灵在体内组织器官水平对血管生成的影响。结果 蟾毒灵对ECV304细胞的生长有抑制作用,且呈浓度和时间的依赖性。24、48、72 h IC50分别为1.104、0.355、0.090 5 ?g/mL。鸡胚绒毛尿囊膜实验表明蟾毒灵可显著抑制血管生成的作用,并呈浓度依赖性。结论 蟾毒灵具有明确的抑制血管内皮细胞增殖、抗血管生成的作用。

【关键词】  蟾毒灵;抗血管生成;血管内皮细胞;鸡胚绒毛尿囊膜

　　A Preliminary Study on Anti-angiogenesis Effect of Bufalin ZAI Xiao-feng1, LV Xiang2, GU Wei1, et al (1.Changhai Hospital of The Second Military Medical University of PLA, Shanghai 200433, China;2.Shanghai TCM Hospital, Shanghai 200071, China)

　　Abstract：Objective To observe the anti-angiogenesis activity of bufalin and find the best reasonable concentration for further clinical use. Method The inhibitory effect of bufalin on ECV304 cells in different times and concentrations was tested by MTT method, its concentration-effect and time-effect relationship was analyzed and their IC50 was calculated. The anti-angiogensis effect in vivo was tested by the method of chorioallantoic membrane (CAM). Result Bufalin had inhibition growth effect on ECV304 cells with different level, and had concentration and time dependence. The IC50 of 24, 48, 72 h were 1.104, 0.355, 0.090 5 ?g/mL respectively. In test of CAM, different concentrations of bufalin could inhibit the angiogenesis of CAM (P<0.01) with concentration dependency. Conclusion Bufalin can inhibit the proliferation of vascular endothelial cell and has anti-angiogenesis effect.

　　Key words：bufalin;anti-angiogenesis;vascular endothelial cell;chorioallantoic membrane

　　血管生成是恶性肿瘤生长、侵袭和转移过程中必不可少的环节,而抗血管生成作为一种新的抗肿瘤治疗手段日益受到重视。蟾蜍是我国传统的中药材,很早就有蟾蜍全虫或蟾酥内服及外用治疗癥瘕积聚、痰注、恶疮等类似肿瘤疾病的记载。蟾毒灵(Bufalin,二羟蟾毒二烯酸内脂)是从中药蟾酥中提取的一种毒性配基之一,现代研究显示,蟾毒灵在体外对人白血病、胃癌及肝癌细胞生长均有一定的抑制作用[1-4],我们的前期研究也发现蟾毒灵是蟾蜍中体外抗肝癌药理活性最强的单体之一[5]。但有关蟾毒灵抗血管生成作用的研究却鲜有报道,本研究观察其对人脐静脉内皮细胞ECV304生长的影响,并观察了蟾毒灵对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)新生血管形成的影响。现报道如下。

　　1 实验材料

　　DMEM培养基、10% 胎牛血清、1∶250胰蛋白酶等为美国Gibco公司产品,HEPES缓冲液为德国Merck公司产品,四甲基偶氮唑盐(MTT)、蟾毒灵为Sigma公司产品。人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞购自中国科学院海细胞生物研究所,白皮受精鸡蛋购自上海太平洋家禽有限公司。MIQAS医学图像定量分析软件由上海申腾信息技术有限公司提供。

　　2 实验方法

　　2.1 人脐静脉内皮细胞ECV304的培养

　　细胞解冻后于含10%胎牛血清的DMEM培养液,37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养,取指数生长期细胞用于实验。

　　2.2 对体外培养ECV304细胞生长活性的影响

　　ECV304细胞以5×104/孔接种,10%小牛血清的DMEM培养液,37 ℃、5%CO2培养至融合状态,换成无血清培养液培养24 h后,加入不同浓度蟾毒灵(分别为3.8×10-5、3.8×10-4、3.8×10-3、3.8×10-2、0.38、3.8 ?g/mL);阴性组为不加药物处理的细胞悬液;空白组为无细胞及药物的培养液。作用24、48、72 h 3个时间点采用MTT法检测细胞生长抑制率。抑制率(IR%)=[(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值]×100%。并采用加权直线线性回归法求得细胞生长抑制率为50%时的药物浓度。

　　2.3 对鸡胚尿囊膜血管生成的抑制作用

　　种蛋置于37 ℃培养箱中孵化第7日,消毒,开窗,制备假气室。放置无菌明胶海绵小块(4 mm×4 mm×4 mm),分别滴加不同浓度的蟾毒灵(3.8×10-3、3.8×10-2、0.38 ?g/mL);对照组加同体积生理盐水。封闭窗口孵育72 h后固定,剪下约3 cm×3 cm的尿囊膜拍摄并进行图像定量分析。

　　3 统计学方法

　　所有数据采用SPSS11.5统计软件处理。选择方差分析进行方差齐性检验,多组均数间两两比较采用Student-Newman- Keuls法。P<0.05提示差异有统计学意义。

　　4 结果

　　4.1 不同浓度蟾毒灵对ECV304细胞增殖的影响

　　不同浓度的蟾毒灵对ECV304细胞生长均有不同程度抑制作用(P<0.05),实验中最低浓度(3.8×10-5 ?g/mL)抑制率即可达16.4%,且抑制作用随药物浓度递增而提高,同一时间各浓度间差异有统计学意义(P<0.05),提示其作用具有浓度依赖性。

　　4.2 药物作用时间对ECV304细胞增殖的影响

　　随着作用时间的延长,蟾毒灵抑制效果增强,作用呈现时间依赖性,同浓度不同时间差异显著。72 h时低浓度(3.8×10-5 ?g/mL)抑制率即可达23.45%,而高浓度时(3.8 ?g/mL)抑制率达81.87%,显示出较强的抑制作用。24、48、72 h的IC50分别为1.104、0.355、0.090 5 ?g/mL。见表1。表1 蟾毒灵对ECV304细胞的抑制作用(—(—制)±s)

　　4.3 蟾毒灵对鸡胚绒毛尿囊膜血管形态的影响

　　对照组明胶海绵周围CAM血管良好,呈树枝状,分支适中,呈非特异性的贯穿、杂乱、包绕、叶脉样、平行生长,而实验组明胶海绵周围CAM血管数目明显减少,出现无血管区或血管断裂现象,且血管变细,血管形态异常,尤其细小血管数显著减少,表明有明显抑制血管生成作用,且随浓度增加抑制作用更明显。

　　4.4 蟾毒灵对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响

　　各实验组对CAM血管形成均呈现较强的抑制作用,在1、5 mm范围内均可显著抑制血管生成(P<0.01),高浓度蟾毒灵可抑制1 mm范围内52.11%的血管形成,5 mm范围内血管的抑制率达56.64%。比较各组抑制率,可见除1 mm范围内3.8×10-3 ?g/mL组与3.8×10-2 ?g/mL组间无明显差异外,各浓度组抑制率均较前一浓度差异有统计学意义(P<0.05),提示其作用有着浓度依赖性。蟾毒灵作用72 h对CAM血管生成的抑制作用见表2。表2 不同浓度蟾毒灵对CAM血管生成的抑制作用(—(—生)±s)

　　5 讨论

　　抗肿瘤血管生成治疗不同于单一攻击肿瘤细胞的思路,将肿瘤放在与周围环境相互交流的整体中审视,通过抑制非肿瘤细胞达到抑瘤效果,在某种程度上与中医药治疗肿瘤强调整体的观念不谋而合。受这一思路的启发,近年来许多研究者把目光投向了中药抗肿瘤血管生成的领域,对多种抗肿瘤中药在抑制血管生成方面的作用进行了深入研究。在中药单体成分中,对人参皂苷、姜黄色素、槲皮素等有较多研究[6-10],从血管生成的不同环节阐释了抑制肿瘤的机制;对单味中药及中药复方的研究同样也在不断探索中,但总体上中药抗肿瘤药物的抑制血管生成研究还处于探索阶段。

　　我们在既往对蟾毒灵抗肝癌体外研究中发现,微摩尔级的蟾毒灵对人肝癌细胞系SMMC7721和BEL-7402有很强的杀灭作用[5];体内研究也发现大、中剂量的蟾毒灵对小鼠原位移植性肝癌有明显的抗肿瘤效应,表现为瘤体缩小和带瘤生存期延长,其作用机制与上调Bax表达、诱导细胞凋亡及细胞周期G2/M期阻滞有关[10-13]。本次研究我们观察了蟾毒灵对人脐静脉内皮细胞ECV304生长的抑制作用。血管内皮细胞的分裂和增殖是肿瘤血管生成的物质基础,在血管生成过程中起关键作用。因此,我们以ECV304细胞为对象进行观察,以明确不同浓度的蟾毒灵有无抑制血管内皮细胞增殖进而阻止血管生成的作用。实验结果显示,蟾毒灵对ECV304细胞生长有抑制作用,并呈现浓度和时间依赖性,而其在较低浓度、较短时间时即可显示出一定的抑制作用;同时,研究抗血管生成药物经典的体内实验方法鸡胚绒毛尿囊膜法也证明了蟾毒灵的抗血管生成作用。

　　抗血管生成是研究中药抗肿瘤治疗的一个重要内容,我们的研究初步表明,蟾毒灵有抑制血管内皮细胞增殖、抗血管生成的活性,而其抑制血管生成的具体机制还需要进一步深入研究。

【参考文献】
  　[1] Yamado K, Hino K, Tomoyasu S, et al. Enhancement by bufalin of retinoic acid-induced differentiation of acute promyelocytic leukemiacells in primary culture[J]. Leuk Res,1998,22(7)：589-595.

　　[2] Yeh JY, Huang WJ, Kan SF, et a1. Effects of bufalin and cinobufagin on the proliferation of androgen dependent and independent prostate cancer cells[J]. Prostate,2003,54(2)：112-124.

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　　[6] 陈明伟,马爱群,倪 磊,等.人参皂甙对肺癌细胞和血管内皮细胞增生、凋亡及其周期的影响[J].中南大学学报(医学版),2005,30(2)：149-152.

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　　[8] 高承贤.姜黄素对血管生成影响的实验研究[J].中药材,2003,26(7)：105-107.

　　[9] 杨和平,李剑明,唐春兰.姜黄色素活性单体成分抗血管生成的实验研究[J].第三军医大学学报,2005,27(11)：1068-1070.

　　[10] 王晓庆,梁中琴,顾振纶,等.槲皮素抑制血管生成作用的实验研究[J].中国药理学通报,2004,20(10)：1161-1164.

　　[11] 韩克起,顾 伟,苏永华,等.蟾毒灵抗小鼠原位移植性肝癌整体药效学研究[J].中华实验外科杂志,2004,21(12)：1436-1438.

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　　[13] 顾 伟,韩克起,苏永华,等.蟾毒灵对裸鼠人肝癌移植瘤的抑制作用及对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响[J].中西医结合学报,2007,5(2)：155-159.