作者：曹 炜1,陈 凯1、2,王 阶1    作者单位：(1.中国中医科学院广安门医院,北京 100053;2.北京中医药大学,北京 100029)

【关键词】  干细胞;诱导剂;丹酚酸;丹参素;丹参酮;三七总皂苷;综述

　干细胞是具有自我复制能力的多潜能细胞,在一定条件下,可以分化成多种功能细胞。目前,干细胞移植临床用于修复受损器官,在某些病种如白血病、股骨头坏死、急性心血管病变等领域已取得突破性进展。但干细胞移植后在一定条件下才能分化和增殖,受干扰因素非常多,而且存活率往往不理想。所以,学术界期望找到合适的诱导剂和条件以保证干细胞沿预期方向分化、增殖,并取得足够存活量和存活期。另外,作为诱导剂,西药的诱导力度比较强且稳定,如5-氮杂胞苷最常用,但如果应用于人体,其毒性往往令人望而却步,而且其诱导的干细胞存活率、存活时间不能令人满意。王氏等[1]基于干细胞研究成果,提出了有关干细胞的理论假说,为中医药理论基础研究展示新的思路,并指出,通过探讨中药在干细胞移植中的治疗机理,寻找高效的诱导分化剂,提高成年干细胞或胚胎干细胞诱导分化成理想细胞的成功率,是中医治疗理论创新的时代要求。近年来,有关中药单体成分对干细胞分化的影响研究所取得的成就已为业界公认。为此,笔者选取近10年来有关丹参、三七单体成分在干细胞诱导分化方面的研究进行整理,对所选用文献中干细胞提纯方法、诱导剂浓度进行了归纳分析,希望对今后的进一步研究有所帮助和启发。

　　1 资料与方法

　　文献检索策略：应用计算机检索“中国期刊全文数据库”和“维普中文科技期刊数据库”1999-2009相关文献;检索词为“干细胞、丹酚酸、丹参素、丹参酮、三七总皂甙(苷)”。纳入标准：内容与中药单体成分丹酚酸或丹参素或隐丹参酮或丹参酮ⅡA或三七总皂甙(苷)或三七皂苷及干细胞有关的文献。排除标准：较陈旧及重复的文献,非中药单体而是中药复方的文献,与干细胞无关及属于临床疗效观察的文献。

　　文献评价：共收集到42篇相关文献,排除17篇,25篇文献符合标准,其中1篇是述评类文献,其余均为实验研究性文献。25篇中1篇介绍干细胞研究对中医药理论发展的思考,15篇介绍丹参不同单体成分的文献,9篇是关于三七单体成分的文献。

　　2 丹参单体作为干细胞分化诱导剂的研究

　　2.1 诱导干细胞向心肌细胞分化

　　陈氏等[2]用贴壁培养法分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),免疫荧光法检测细胞抗原CD44和CD34,分别用含5 μmol/L的5-氮胞苷(5-aza)和30 mg/L丹酚酸B(SalB)的低糖DMEM培养液培养MSCs 24 h后,RT-PCR法检测心肌特异性转录因子Nkx2.5、GATA-4和心肌特异性蛋白α-actin mRNA的表达。结果显示,用贴壁培养法可获得纯化的MSCs,SalB可诱导MSCs向心肌样细胞分化。研究人员通过培养、纯化及鉴定大鼠MSCs,用SalB、5-aza、SalB联合5-aza分别定向诱导分化,观察此过程中MSCs的形态学变化并采用免疫细胞化学法鉴定诱导后MSCs心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)的表达,检测GATA-4和Nkx2.5基因表达。结果SalB可在体外诱导大鼠MSCs定向分化为心肌样细胞,其与5-aza联合诱导可明显提高MSCs向心肌细胞分化的能力,并且在Nkx2.5基因表达上SalB的优势更加明显,其中SalB纯度为78%(终浓度为250 μg/L)[3-5]。华氏等[6]选用成年近交系Wistar大鼠,利用percol1分离液进行密度梯度离心法和直接贴壁法进行分离、提纯MSCs,并进行培养扩增;免疫组化方法对第9代MSCs表面抗原进行鉴定。分别应用10 μmol/L 5-aza及250 μg/L SalB联合5-aza对第9代MSCs联合诱导24 h,于诱导后第4周检测Desmin、α-actin mRNA的表达。结果发现,SalB具有促进5-aza诱导的MSCs向心肌样细胞分化的作用。

　　2.2 诱导干细胞向神经元样细胞分化

　　庹氏等[7]观察SalB诱导小鼠胎脑神经干细胞分化后细胞膜结构,发现SalB诱导神经干细胞分化神经元细胞膜的窗孔样结构与小凹明显增多,提出可能与SalB增强细胞内外物质交换功能和促进细胞内信号转导有关,其中SalB在培养基中终浓度为0.5 μg/mL。原氏等[8]体外分离培养猴MSCs,流式细胞仪检测其表面标志,用含隐丹参酮的无血清L-DMEM诱导MSCs分化为神经元样细胞,发现隐丹参酮可在体外将猴MSCs诱导分化为神经元样细胞,其中隐丹参酮浓度为20 mg/L。夏氏等[9-10]采用Ficoll-Paque液分离成人MSCs,体外扩增,流式细胞仪检测表面抗原表达,采用含隐丹参酮与丹参酮Ⅱ(TanⅡA)无血清DMEM诱导MSCs分化为神经元样细胞。指出隐丹参酮体外可诱导成人MSCs分化为神经元样细胞,TanⅡA体外可诱导成人MSCs分化为神经元样细胞,其中TanⅡA浓度为25 μmol/L。余氏等[11-12]采用含丹参素与丹参酮的无血清L-DMEM诱导人MSCs分化为神经元样细胞,并且探讨了丹参素与丹参酮不同浓度及不同作用时间对MSCs诱导分化为神经元样细胞的影响。发现丹参素可以在体外诱导MSCs分化为神经元样细胞,其诱导转化率与丹参素浓度和作用时间有关。在经碱性成纤维生长因子(bFGF)预诱导后,用10 μg/mL丹参素诱导5 h作用最为显著。丹参酮可以在体外诱导MSCs分化为神经元样细胞,在浓度为5 μg/mL时诱导作用最为明显。

　　2.3 对干细胞的其他作用

　　孙氏等[13]用密度梯度法分离、培养兔MSCs,18只兔随机分为空白组、丹参素和克伦特罗组,观察形成的MSCs成纤维样集落数目,并用流式分析法鉴定。发现丹参素和克伦特罗对兔MSCs有增殖作用,其中丹参素浓度为10 μg/mL。陈氏等[14]采用密度梯度离心法获得外周血内皮祖细胞(EPC),体外进行诱导、分化和扩增,于培养第7日选择免疫荧光鉴定EPC,观察不同浓度TanⅡA对EPC增殖和迁移的影响,提出TanⅡA能改善EPC的增殖、迁移和粘附能力的观点,且0.8 mg/L TanⅡA达最大效应。巢氏等[15]采用细胞培养法,以新生24 h内大鼠海马神经干细胞为研究对象,制备缺氧、氧自由基损伤模型,观察神经干细胞损伤后变化,四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定OD值。结果发现,丹参酮对神经干细胞缺氧、氧自由基损伤具有保护作用,尤以80 μmol/L组保护作用最明显。郭氏等[16]以丹参素、丹酚酸为干预药物,观察其对胎鼠脑神经干细胞迁移的诱导作用及不同浓度丹参素、丹酚酸的差异,并观察了在小鼠体内条件下,丹参素和丹酚酸对小鼠室管膜下nestin阳性神经元迁移的影响,得出丹参素和丹酚酸均具有诱导胎鼠脑神经干细胞迁移的作用,丹酚酸的作用优于丹参素,丹酚酸浓度为40 mg/L时促迁移作用最强的结论。

　　3 三七总皂苷作为干细胞分化诱导剂的研究

　　3.1 诱导干细胞向心肌细胞分化

　　李氏等[17]采用骨髓细胞体外培养技术分离大鼠MSCs,以流式细胞仪检测细胞表面标志;采用MTT法观察PNS对MSCs增殖的影响;采用第8代MSCs进行体外心肌细胞诱导分化并鉴定心肌细胞。结果发现,PNS能促进大鼠MSCs体外增殖并可诱导MSCs分化为心肌样细胞,并且短期(第1、3日)、低浓度(50 mg/L)时PNS促进MSCs增殖,长期(第5日)、高浓度(250、400 mg/L)时PNS则明显抑制MSCs增殖,150 mg/L的PNS在第3日对MSCs的增殖效果最好,为最佳浓度。

　　3.2 诱导干细胞向神经元样细胞分化

　　撒氏等[18]通过体外扩增、提纯MSCs,选用第5代后的MSCs进行诱导分化。用10 μg/L bFGF预诱导24 h,而后换成含PNS的无血清培养基DMEM诱导MSCs分化为神经元样细胞。用免疫组化SABC法鉴定神经丝蛋白、神经元特异性烯醇化酶、巢蛋白、微管联合蛋白-2、生长相关蛋白-43和胶质纤维酸性蛋白的表达。发现PNS可诱导MSCs分化为神经元样细胞,其中PNS的浓度为2.5 g/L。施氏等[19]以PNS和维甲酸为诱导剂诱导大鼠MSCs分化,提出PNS和维甲酸联合应用对大鼠MSCs分化为神经元样细胞及在提高其分化率中起着重要作用,其中PNS的浓度为2 g/L。施氏等[20]通过体外培养大鼠MSCs,取第5代细胞,用含20%胎牛血清、1 mmol/L 2-巯基乙醇的完全培养液预诱导24 h,然后分组更换含不同诱导剂的无血清培养液诱导分化,发现PNS在体外能够有效诱导大鼠MSCs分化为神经元样细胞,表达神经递质表型特征;与传统的诱导因子比较,可延长细胞存活时间,具有抗细胞凋亡作用,其中PNS的浓度为2 g/L。魏氏等[21]体外培养海马神经干细胞,按PNS不同浓度梯度和同一浓度的不同时间点进行干预,结果一定浓度范围内的PNS能增强海马神经干细胞活性;PNS能促进海马神经干细胞向神经元和胶质细胞方向分化。PNS浓度在17.5 μg/mL时作用最强。在同一浓度不同时间条件下,PNS在24、48、96 h有意义,且在24 h作用最佳。司氏等[22]选取妊娠l7 d的胎鼠皮层细胞,通过原代细胞培养、传代、单细胞克隆和免疫细胞化学方法,观察到体外条件下PNS可能通过促进胎鼠皮层神经干细胞或前体细胞bFGF、脑源性神经营养因子自身合成增加,通过自分泌或旁分泌作用,促进细胞存活、增殖、分化和自我更新,其中PNS浓度为100 μg/mL。张氏等[23]通过体外培养胎鼠神经干细胞,以β-tublin代表非成熟神经元marker,以tau代表成熟神经元marker,RT-PCR方法检测β-tublin、tau的表达,观察黄芩苷、栀子苷、黄芪甲苷、PNS对神经干细胞分化及成熟的影响。结果发现,黄芩苷、栀子苷能诱导神经干细胞特异性分化成神经元,而联合应用黄芪甲苷、PNS能进一步促进分化神经元的成熟,各中药单体高浓度10 μg/mL,低浓度1 μg/mL。

　　3.3 诱导干细胞向其他细胞分化

　　王氏等[24]体外分离、培养兔MSCs,取第3代细胞,随机分为空白组、模型组和不同浓度PNS组。检测细胞内三酰甘油含量与碱性磷酸酶活性,发现50、100 mg/L PNS抑制酒精诱导的兔MSCs成脂分化,而促进成骨分化,可能有治疗酒精性股骨头缺血性坏死的作用。钱氏等[25]用Dynal M-450 CD34+免疫磁珠阳性选择法获取高纯度的人骨髓CD34+细胞,采用多向祖细胞体外集落培养和流式细胞术检测细胞增殖与分化。发现PNS对CD34+造血干/祖细胞不但具有显著的刺激增殖作用,而且25、50、100 mg/L的PNS能够诱导其向粒系细胞定向分化。

　　4 问题及展望

　　笔者通过选用近10年相关文献,总结丹参和三七的单体成分作为诱导剂取得的研究成果,着重对文献中干细胞提纯方法、诱导剂浓度进行整理归纳分析。可得出如下结论：①在干细胞的培养、提纯方面,运用了直接贴壁培养法、密度梯度离心法、免疫磁珠分选法及流式细胞法等,有单独使用一种方法的,也有两种或两种以上方法联合使用,都得到了比较理想的干细胞增殖结果。②无论是丹参单体还是三七单体,都能成功诱导干细胞向心肌细胞、神经元样细胞等多种细胞分化。③丹参单体作为诱导剂时所使用的浓度从250 μg/L到40 mg/L,相差数百倍,不同的丹参单体最佳浓度各异。三七单体作为诱导剂时所使用的浓度从1 mg/L到2.5 g/L,相差数千倍,最佳浓度也各异。

　　丹参素、SalB、丹参酮、隐丹参酮、TanⅡA等作为丹参的单体成分,具有不同程度的抗氧化、抗衰老功能。PNS作为三七的活性成分,与丹参的上述单体成分一样具有活血祛瘀的功效。这些单体诱导干细胞分化及一定程度上提高干细胞成活率可能与其抗氧化、抗衰老及活血祛瘀作用有关。

　　但上述研究尚存不少问题：①西药作为诱导剂,其诱导分化作用多有明确定向,而同一中药单体往往可以诱导同一种干细胞分化为多种功能细胞,即多元分化作用,这既是中药单体作为诱导剂的优点,也是得不到国外学者认可的原因所在,故中药的多元分化作用有待进一步研究探讨和分析。②国内虽有不少研究应用中药单体诱导MSCs增殖和分化,但它们的起效浓度相差非常大,难以重复,也得不到公认,因此,需进一步规范化研究。③人体是一个复杂的内环境,而目前在体外条件取得的研究成果未必在体内就能重现,对此需开展更具针对性的研究。

　　干细胞在临床医学上的应用随着各项研究的进展和技术的成熟越来越广泛,将给患有白血病、股骨头坏死、急性心血管病变等疑难杂症患者带来新的希望。相对于西药诱导剂,中药毒副作用小,被广泛用于辅助诱导MSCs增殖分化已时机成熟。由于中药复方非常复杂,因此,目前广大研究者多选用中药单体成分作为诱导剂,并取得了可喜成果,这些成果最终必将造福人类。

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