【摘要】 目的建立超高速液相色谱法(UFLC)同时测定金银花中木犀草苷、金丝桃苷及绿原酸的含量。方法采用UFLC法，色谱柱为岛津XR-ODS色谱柱(75 mm×3.0 mm，2.1 μm)，以乙腈和0.05%磷酸溶液为流动相梯度洗脱;检测波长350nm，流速1.0 ml·min-1，柱温45℃。结果木犀草苷在0.021 48～1.074 μg范围内呈良好线性关系(r=0.999 9)，回收率为98.45%(n=6)，RSD=1.21%;金丝桃苷在0.020 48～1.024 μg(r=0.999 9)范围内呈良好线性关系，回收率为96.77%(n=6)，RSD=0.56%;绿原酸在0.202 1～10.104 μg范围内呈良好线性关系(r=0.999 6)，回收率为99.12%(n=6)，RSD=0.87%。结论方法分析时间短、结果准确，重复性好，可用于金银花的质量控制。
【关键词】 超高速液相色谱法; 金银花; 木犀草苷; 金丝桃苷; 绿原酸
金银花是忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花，性寒、味甘，归肺、心、胃经。具清热解毒、疏散风热之功效，临床用于治疗痈肿疔疮，喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温病发热等症[1]。金银花中所含成分较为复杂，包括有机酸类、黄酮类、三萜皂苷类及挥发油类。目前对于金银花药材的含量测定主要集中在HPLC法测定绿原酸和木犀草苷[2，3]，但其分析时间长，分离效果差。超高速液相色谱仪(UFLC)是日本岛津公司近两年推出的新型液相色谱仪，其采用特殊技术，使得分析时间大为缩短，可以有效的节省溶剂量。本文以木犀草苷、金丝桃苷、绿原酸为指标成分，采用UFLC梯度洗脱法同时对金银花中3种成分进行含量测定。
1 仪器与试药
1.1 仪器日本岛津LC-20A 超高速液相色谱仪;日本岛津LC Solution色谱工作站。
1.2 试剂及试药木犀草苷对照品(批号：111524-200601)，金丝桃苷(批号：111521-200603 )，绿原酸(批号：110753- 200703)，均由中国药品生物制品检定所提供;乙腈、乙醇为色谱纯(美国Tedia公司)，水为二次蒸馏水，其余试剂均为分析纯;12批金银花样品，经辽宁省食品药品检验所王维宁副教授鉴定，均为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾。
2 方法与结果
2.1 色谱条件色谱柱为岛津XR-ODS色谱柱(75 mm×3.0 mm，2.1 μm);柱温45℃;检测波长350 nm;流速1.0 ml·min-1;梯度洗脱，流动相A为乙腈，流动相B为0.05%磷酸溶液，线性梯度洗脱，梯度变化见表1;理论板数按木犀草苷峰计算应不低于3 000;峰的分离度均应符合要求，所有组分在10.2 min内检测完毕。表1 流动相梯度变化表
2.2 对照品溶液的制备精密称取木犀草苷对照品5.37 mg、金丝桃苷对照品5.12 mg，绿原酸对照品50.52 mg，置同一50 ml容量瓶中，加70%乙醇适量使溶解并稀释至刻度，得混合对照品溶液Ⅰ(上述3组分浓度分别为0.1，0.1， 1.0 mg·ml-1)。精密吸取混合对照品溶液Ⅰ5 ml，置25 ml容量瓶，加70%乙醇稀释至刻度，得混合对照品溶液Ⅱ(上述3组分浓度分别为20，20，0.2 mg·ml-1)。对照品色谱图见图1～3。图1 绿原酸对照品UFLC图谱图2 金丝桃苷对照品UFLC图谱图3 木犀草苷对照品UFLC图谱
2.3 供试品溶液的制备取本品细粉(过4号筛)约3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 ml，称定重量，超声处理(功率250 W，频率33 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。供试品色谱图见图4。
2.4 线性关系分别吸取对照品溶液Ⅱ1，2，5，10 μl，对照品溶液Ⅰ5，10 μl注入液相色谱仪中，测定色谱峰面积，测定结果回归处理。木犀草苷回归方程为： Y= 2.918×105X+3.020×104，r=0.999 9，木犀草苷进样量在0.021 48～1.074 μg范围内线性关系良好;金丝桃苷回归方程为：Y= 3.122×105X+3.329×104，r=0.999 9，金丝桃苷进样量在0.020 48～1.024 μg范围内线性关系良好;绿原酸回归方程为：Y= 8.347×105X+2.158×104，r=0.999 6，绿原酸进样量在0.202 1～10.104 μg范围内线性关系良好。图4 金银花样品UFLC图谱
2.5 稳定性实验精密吸取同一供试品溶液，在0，2，4，6，8，12 h分别进样10 μl，测定，木犀草苷、金丝桃苷和绿原酸峰面积的RSD分别为0.56%，0.32%，1.28%。结果表明，供试品溶液中的木犀草苷、金丝桃苷和绿原酸在室温放置12 h内基本稳定。
2.6 精密度实验精密吸取同一供试品溶液，连续进样6次，10 μl/次，木犀草苷、金丝桃苷和绿原酸峰面积的RSD分别为0.69%， 0.42%，0.56%。结果表明，其精密度良好。
2.7 重复性实验取同一批金银花样品研细，取约3 g，精密称定，共取6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件分别进样10 μl，结果供试品中的木犀草苷、金丝桃苷和绿原酸含量的RSD分别为1.05%，0.78%，1.42%，表明其重复性良好。
2.8 回收率实验取重复性实验同批金银花样品，研细，取约1.5 g，精密称定，共取6份，分别加入对照品混合溶液Ⅰ10 ml，绿原酸对照品溶液(1.023 mg/ml)15 ml，按“2.3”项下方法制备供实品溶液，按上述色谱条件分别进样10 μl，结果供试品中的木犀草苷、金丝桃苷和绿原酸的平均加样回收率分别为98.45%(RSD=1.21%)，96.77%(RSD=0.56%)，99.12%( RSD=0.87%)，表明其回收率良好。
2.9 样品含量测定结果取12批供试品，按“2.3”项下操作，在上述色谱条件下进样分析。结果见表2。表2 样品含量测定结果
3 讨论
UFLC相比传统的HPLC可以达到快速分离，缩短时间约82%，节约分析时间，节约分析溶剂。UFLC所用色谱柱比传统ODS色谱柱粒径小，分离机制与传统色谱柱不尽相同，导致金银花各成分出峰顺序与传统方法不尽相同。
【参考文献】
[1] 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[S].北京:化学工业出版社，2005.
[2] 刘高峰，孙考祥，黄丽君，等.HPLC法测定不同生长期金银花中绿原酸含量[J].中医药学报，2001,29(6):51.
[3] 李 丽，田义杰，毛崇武，等.RP-HPLC测定金银花3种成分的含量[J].中成药，2008，30(1)：134.
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