【摘要】  目的 人凝血因子 (coagulation factorⅩⅢ，FⅩⅢ) 是参与凝血过程的最后一个凝血因子，又称纤维蛋白稳定因子(fibrin stabilizing factor)。它可使松弛的纤维蛋白单体发生交联而变得紧密而坚固。遗传性FⅩⅢ缺陷症是一种罕见的常染色体隐性遗传病，发病率约1/2000000。其临床特点为：以脐带出血最常见；外伤后延迟性血肿形成，女性患者易反复流产，男性患者有不育等。目前认为此病主要由于F13基因缺陷造成。本研究对1例遗传性FⅩⅢ缺陷症家系进行了基因诊断，现报告如下。

【关键词】  人凝血因子ⅩⅢ； 纤维蛋白稳定因子；遗传性FⅩⅢ缺陷症；基因

　　1  F的生物学特性及功能

　　在血浆中FⅩⅢ是以四聚体(A2B2)形式存在，包括2个A亚基和2个B亚基。二者分别由不同类型的细胞合成，A亚基由巨噬细胞、单个核细胞、血小板等合成，在细胞中形成二聚体(A2);而B亚基是分泌型蛋白，主要由肝细胞合成，在血浆中形成二聚体(B2)。A亚基为催化亚基，B亚基以单体分别与A2二聚体连接，这一过程是在血浆中完成的。B亚基作为载体保护A亚基免于降解，促进A亚基与纤维蛋白的亲和，并可调节A亚基的蛋白酶活性。在 Ca2+的作用下，FⅩⅢ四聚体可逆性解离成二聚体，但此时A2仍无酶活性，要通过凝血酶的裂解和Ca2+的继续作用下发生构象改变，暴露巯基活性中心才能被活化。纤维蛋白原及早期纤维蛋白降解产物能加速FⅩⅢ的激活速度。FⅩⅢA亚基具有谷氨酰胺转移酶活性，催化纤维蛋白单体分子间γ-谷氨酰胺-ε-赖氨酸交联，以形成γ链二聚体以及大分子量的α链多聚体为主;某些F13基因缺陷时可能会影响到交联形式的改变。 FⅩⅢA亚基还能使纤维蛋白α链与α2抗纤溶酶(α2-AP)、纤维连接蛋白(Fn)、凝血酶敏感蛋白(TSP)、血管性血友病因子(vWF)等分别交联，也可使胶原蛋白与纤维蛋白交联，进而使血小板-纤维蛋白-内皮细胞形成网状结构，有助于止血和伤口愈合。B亚单位尚未发现具有催化活性，但可能起稳定和调节A亚单位的作用［1~3］。FⅩⅢ不仅作用于纤维蛋白，还在α2-抗纤溶酶、vWF、凝血酶敏感蛋白(thrombospondin)和纤维连结蛋白等参与形成纤维蛋白网(fibrin network)过程中起协同作用［4~8］。FⅩⅢ不仅参与调节生理性止血机制，还在组织炎症及组织细胞间连接、伤口愈合等过程中发挥重要作用。一些研究观察发现，低水平FⅩⅢ可能存在如炎症性肠病(克隆病、溃疡性结肠炎)及几种妇科肿瘤中［9~16］，提示FⅩⅢ与炎症、肿瘤有一定关系，但有待进一步证实。

　　2  F13基因及遗传性凝血因子ⅩⅢ缺陷症

　　正如 FⅩⅢA、FⅩⅢB两个亚基来自不同类型的细胞，它们的基因也分别位于不同的染色体上。A亚基基因位于6p23-25，基因长度160kb，有15个外显子和14个内含子，mRNA长3.8kb，编码731个氨基酸，编码起点是从第2个外显子开始。B亚基基因位于1q31-32.1，基因长度28kb，有12个外显子和11个内含子，mRNA长219kb，编码661个氨基酸。

　　A或B两个亚基任何一个基因缺陷均将导致遗传性FⅩⅢ缺乏症，临床上把它分为 I 型（A和B亚基共同缺失）和Ⅱ型（仅A亚基缺失）。F13 基因缺陷导致血栓凝块不稳定，易被溶解，这是出血发生的基础。据最新的数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）统计F13 基因突变类型共66种。绝大多数发生在FⅩⅢA基因（63种）：错义突变几乎占半数，错义突变30种，剪切位点突变8种，无意突变6种，缺失13种，插人5种，大片段缺失1种。其中大部分的错义突变发生在外显子6和外显子12上，而外显子13上还未发现有序列的改变。FⅩⅢB基因缺陷类型有3种：错义突变1种，缺失1种，插入1种。

　　遗传性凝血FⅩⅢ缺陷症为常染色体隐性遗传。在血浆中FⅩⅢ是以四聚体(A2B2)形式存在，包括2个A亚基和2个B亚基。二者分别由不同类型的细胞合成：A亚基由巨噬细胞、单个核细胞、血小板等合成，在细胞中形成二聚体(A2);而B亚基是分泌型蛋白，主要由肝细胞合成，在血浆中形成二聚体(B2)。A或B两个亚基任何一个基因缺陷均可导致遗传性FⅩⅢ缺乏症；临床上可将其分为I型(A和B亚基共同缺失)缺陷和Ⅱ型缺陷（仅A亚基缺失）两种类型。据最新的FⅩⅢ数据库统计（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），F13 基因缺陷类型总计有66种：包括错义、无义、剪切位点、插入、缺失、大片段缺失等6种突变，其中错义突变最常见，约占45%；最少见的突变是大片段缺失，且绝大多数突变发生在F13 A基因（63种）。本例先证者为一重型遗传性凝血FⅩⅢ缺陷症患者。患者出生时有脐带出血史，用凝块溶解时间检测FⅩⅢ：C(FⅩⅢ活性)短于2h，对该患者的F13 基因各外显子进行基因测序后发现患者在6号外显子处有1个错义纯合突变：74619位G→A，导致Arg(CGU)260被His（CAU）替代。AS-PCR证实了这一突变。

　　FⅩⅢA有4个结构域，N端到C端依次为βsandwich（Glu43-Phe184）、core（Asn185-Arg515）、barrel1（Ser516-Thr628）和barrel2（Ile629-Arg727），其中位于core区的催化性三元体Cys314-His373-Asp396是FⅩⅢ转谷氨酰胺酶活性的基础。在core区目前已报道了多种突变，为突变热点。本研究发现的Arg260His恰好位于core区，且位于FⅩⅢ酶活性位点的核心位置，正常情况下，Arg260位氨基酸与Asp404位氨基酸和Asp427位氨基酸之间可形成盐键，Asp404和Asp427位于环的附近靠近酶活化位点，共与Arg260的相互作用对环的稳定性和保持酶活性位点的完整性具有至关重要的作用。由于Arg260位在不同种系的转谷氨酰胺酶序列中属于保守的氨基酸序列，此外Asp427也是一个保守的氨基酸，因此可以推断这两个氨基酸之间形成的盐键在维持蛋白活化位点的稳定性方面具有重要的作用。从计算机模拟的蛋白质三维结构图中可以看出，当Arg260被His替换后，Arg260位、Asp404位和Asp427位氨基酸之间的盐键消失。同时，在Arg260和Asp404之间可形成弱的氢键。原核生物的体外表达试验结果显示，突变蛋白的表达量减少，同时蛋白活性受到严重影响，推测低水平的蛋白质表达可能是由于突变蛋白或mRNA的加速降解而引起的。

　　从上述的研究资料我们可以推测由于Arg260位点可能位于酶活化位点的表面，其与周围相关氨基酸之间的相互关系对蛋白质的稳定性和正常功能的发挥中都具有重要的作用，该位点发生突变后可影响蛋白的三维构象发生改变，使突变蛋白发生错误折叠、稳定性降低或合成减少，从而引起酶的失活、蛋白表达降低。因此，该位点的突变是引起该先证者发生遗传性凝血因子FⅩⅢ缺陷症的主要分子发病机制。

　　F13基因缺陷可影响FⅩⅢ的表达及其稳定性。核苷酸的插入和（或）缺失以及剪接位点的突变常引起编码框架的移位，导致错误氨基酸的合成，或编码提前终止而产生截短型蛋白或无蛋白的合成，后果似乎更为严重。而关键位点的单核苷酸变化同样导致FⅩⅢ的功能缺陷，它们往往引起蛋白质空间构型的变化引起非正常的折叠，从而影响蛋白质在细胞内的稳定性，即使有部分活性，也由于极不稳定而很快被降解［16~20］，如Arg260Leu、Ala318Val、Thr398Asn 和Gly210Arg这四种突变可引起细胞内相应的蛋白稳定性，使其迅速的降解;或直接影响到mRNA的稳定和转录效率。缺陷FⅩⅢ常因得不到稳定的蛋白而无法对其空间构象及功能进行研究。目前大量文献报道多采用蛋白质的三维模型软件帮助理解基因缺陷造成的空间构型变化对其功能的影响。

　　在1994年，Yee等就用X晶体衍射的方法确定了FⅩⅢA亚基的三维结构。FⅩⅢA亚基有4个结构域，N端到C端依次为βsandwich（Glu43-Phe184）、core（Asn185-Arg515）、barrel1（Ser516-Thr628）和barrel2（Ile629-Arg727），位于core区的催化性三元体Cys314-His373-Asp396是 FⅩⅢ 转谷氨酰胺基活性的基础。报道中大多数的突变位于core区，为突变的热区。如近期报道的由Onland W等发现的两个新的错义突变Val316Phe (1050 G>T，引起缬氨酸GTT-苯丙氨酸TTT，外显子7)和Gly262Glu（889G>A，引起甘氨酸GGG-谷氨酸GAG，外显子6）就发生在core区，使FⅩⅢ抗原和活性降低导致FⅩⅢ功能缺陷。

　　国内报道的FⅩⅢA基因外显子15复合杂合突变且同时都位于barrel2结构域。发生在barrel2结构域的突变将影响到的蛋白质折叠和稳定性，而之前在此区域报道的错义突变中有仅两种发生在barrel2结构域，患者都为纯合子。

　　遗传性凝血FⅩⅢ缺陷症为常染色体隐性遗传病，发病率约为1/2 000 000。 杂合子患者一般无自发性出血，纯合子和双杂合突变患者可有明显出血倾向，而且仅在血浆FⅩⅢ：C<1%时发生，但临床出血症状的轻重程度与血浆中的FⅩⅢ水平常不相关。即使FⅩⅢA的活性在30%～50%，也可发生严重的出血，特别是在杂合子患者。80%患者的早期症状大多表现为脐带出血，常在出生后脐带残端或脐带疤痕处出血，严重者可危及生命。其次为创伤后伤口血肿形成。其他如皮肤淤点、淤斑，鼻出血，关节肌肉血肿等。25%患者有伤口愈合异常，外伤后数小时才出现出血症状，这是FⅩⅢ缺乏所特有的临床表现，表明患者即刻止血功能正常，但由于在形成的止血血栓中，纤维蛋白呈可溶性，血凝块对纤溶酶敏感性增高，故止血后又复出血。遗传性凝血FⅩⅢ缺陷症的患者主要还是应用替代治疗，替代治疗虽然有效，但不能解决根本问题。基因疗法治疗对遗传性凝血因子缺陷症这样的单基因遗传病是一种有望根治的治疗方案。

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