【关键词】  马钱子 士的宁 正交试验 提取工艺 反向高效液相色谱

  马钱子又名番木鳖，为马钱科植物马钱子(Strychons nuxvomica L．)及云南长籽马钱(Strychnos pierriana A.W.HILL )的干燥成熟种子,主要分布于热带、亚热带地区，性温，有大毒，具有通络止痛、散结消肿之功效，临床用于治疗风湿顽痹、麻木瘫痪、跌打损伤和痈疽肿痛等疾病[1]。马钱子含生物碱约1.5%～5%，主要成分为士的宁约占45%，马钱子碱约占30～40%，其主要成分既是有效成分也是毒性成分[2]。本实验以主要成分士的宁和马钱子碱提取量为指标，采用正交试验法优选马钱子的醇提工艺，报道如下。

1  实验材料 

1.1  药  物  马钱子购自浙江中医药大学中药饮片厂，经鉴定为马钱子合格品。士的宁对照品(0705—9304，中国药品生物制品检定所提供)。马钱子碱对照品（0603—7201，中国药品生物制品检定所提供）。

1.2  仪器与试剂  Agilent Technologies1200 serices高效液相色谱仪(全自动进样)，电子天平(Management  system certified according to ISO 9001)，电热恒温水浴锅（DKS24，上海精宏实验设备有限公司），庚烷磺酸钠, 磷酸二氢钾， 三氯甲烷均为分析纯，甲醇和乙腈均为色谱纯。

2  方法与结果 

2.1  正交试验设计  选择乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数四个考察因素，每个因素取三个水平设计正交试验表，见表1。
表1  因素水平表

水  平乙醇浓度/%乙醇用量/倍提取时间/h提取次数

185100.51

2651512

3452023

2.2  有效成分含量测定 

2.2.1  色谱条件[3]  色谱柱为Agilent ODSC18 (4.6mm×150mm，5μm),流动相：乙腈0.01mol/L、庚烷磺酸钠与0.02mol/L磷酸二氢钾等量混合溶液（用10%磷酸调节pH值2.8）（21∶79）；检测波长：254nm；进样量：5μl；柱温：室温，流速：1.0mL/min；理论塔板数按士的宁峰计算应不低于5 000。

2.2.2  对照品溶液制备[3]  分别称取士的宁对照品12mg,马钱子对照品5mg，精密称定，分别置20ml量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密量取2ml，置同一10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含士的宁0.12mg，马钱子碱0.05mg)。见图1。

2.2.3  供试品溶液制备[4]  称取马钱子粗粉约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氢氧化钠试液3ml，混匀，放置30min，精密加入三氯甲烷20ml，密塞，称定重量，置水浴中回流提取2小时，放冷，再称定重量，用三氯甲烷补足失重，摇匀，分取三氯甲烷提取液，用铺有少量无水硫酸钠的滤纸滤过，弃去初滤液，精密移取续滤液3ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。见图2。

图1  对照品溶液图谱

图2  供试品溶液图谱

2.2.4  线性关系考查  由高效液相全自动进样器精密吸取马钱子碱、士的宁对照品混合溶液1μl、3μl、5μl、10μl、20μl进样，以色谱峰面积为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X），进行线性回归，结果士的宁在0.2452～2.4520μg范围内线性关系良好，回归方程是Y=1549.54X-2.18（r=0.9995）；马钱子碱在0.0536～1.0720μg范围内线性关系良好，回归方程是Y=31344.06X-131.56(r=0.9997)。

2.2.5  精密度实验  精密吸取混合对照品溶液10μl，照上述色谱条件重复进样6次，记录色谱峰面积。结果士的宁的峰面积RSD=0.43%（n=6），马钱子碱的峰面积RSD=0.37%（n=6）。

2.2.6  稳定性实验  取同一浓度的混合对照品溶液，分别于0、2、4、8、12、24小时依法测定，士的宁与马钱子碱峰面积的RSD分别为0.98%和1.07%，结果表明，混合对照品溶液在24小时内稳定。

2.2.7  重复性实验  取正交试验表中的1号试验样品6份，按2.2.3项下条件测定，结果士的宁含量的RSD=1.36%，马钱子碱的含量的RSD=1.57%。

2.2.8  加样回收实验  取同一批已知含量的样品约0.25g，精密称定，共称取6份，精密加入对照品混合溶液3.6ml，按供试品溶液制备方法制备，测定，计算回收率。结果士的宁平均回收率98.83%，RSD=2.87%，马钱子碱平均回收率100.41%，RSD=2.67%。

2.2.9  样品的测定  按照正交设计表中各因素水平提取，收集滤液，挥发大部分乙醇，并用氨水调pH至9～10，用三氯甲烷10ml，10ml，5ml，5ml萃取4次，合并三氯甲烷层，水浴蒸干，残渣用甲醇氨水（9∶ 1）溶解，转移至10ml量瓶中并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3  正交试验结果及分析 
正交试验结果见表2，权重分析结果见表3，方差分析分析结果见表4。

表2  正交试验结果L9（34）

序号

因  素

乙醇浓度/%
A乙醇用量/倍
B提取时间/h
C

指  标

提取次数
D士的宁/(mg/g)
Y1马钱子碱/(mg/g)
Y2

111 117.32491.172

212 224.11140.733

313 3316.31383.003

421 2313.46842.001

522 31 6.47790.767

623 12 4.64390. 695

731 3213.50032.098

832 13 9.37671.570

933 21 6.00341.059

表3  权重分析结果

编号称重士的宁Y1/%权重a马钱子碱Y2/%权重bY1/Y2权重cK

1 1.0180.7195 0.60.3204 0.052.2460 0.351.2338

2 1.0010.4107 0.60.2053 0.052.0005 0.350.9569

3 1.0051.6233 0.60.8280 0.051.9605 0.351.7015

4 1.0131.3296 0.60.6439 0.052.0648 0.351.5526

5 1.0180.6363 0.60.2098 0.053.0327 0.351.4537

6 1.0090.4602 0.60.1927 0.052.3887 0.351.1218

7 1.0031.3460 0.60.5799 0.052.3211 0.351.6490

8 1.0050.9330 0.60.4341 0.052.1494 0.351.3338

9 1.0150.5915 0.60.2911 0.052.0317 0.351.0805

表4  方差分析结果

方差来源偏差平方和自由度FF0.05（2,2）显著性

A0.010 21.00 19.00

B0.087 28.70 19.00

C0.303 230.30 19.00*

D0.157 215.70 19.00

误差0.010 2

    C因素与其余三个因素比较，差异有统计学意义，*P＜0.05

3  结果与验证 

3.1  结果分析  由正交试验士的宁含量方差分析表可知，提取时间对士的宁的含量有显著性差异（P＜0.05），因此，笔者选择每次回流2小时，其他因素对的马钱子碱含量均无显著性差异（P＞0.05），从工业化生产的成本考虑，选择其他因素分别为A3，B1，D2。综上所述，根据正交试验的结果，最佳的提取工艺为：A3B1C3D2，即10倍量45%乙醇回流2次，每次2小时。

3.2  验证试验  根据最佳提取工艺对马钱子总生物碱进行提取，并按“2.3”方法进行含量测定。结果士的宁平均提取率18.47mg/g（RSD=0.81%，n=5）,马钱子碱平均提取率8.26mg/g（RSD=1.20%，n=5）。试验结果表明，士的宁提取率明显高于正交设计中的9个试验结果，士的宁在总生物碱含量中占50%以上，是马钱子碱含量的2倍左右。因此，说明优选提取条件的合理性。

   
由于士的宁药理作用强，副作用小，因而提高士的宁的含量是整个实验设计的关键，占据数据权重的60%；其次是士的宁和马钱子碱的比例，占权重的35%；而马钱子碱毒性较大，在本设计中是最不重要的参考指标，占权重5%。结果马钱子细粉加45%乙醇，10倍量，回流2次，每次2 小时为马钱子主要有效成分提取的最佳条件。

【参考文献】
  [1]
黄喜茹,曹冬.马钱子研究进展[J].上海中医药杂志,2005,39(1):6265.

[2] 马密霞,胡文祥,刘接卿,等.马钱子属植物的药理毒理作用及临床应用进展[J].中国医院药学杂志,2007,27(12):17251728.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京:化学工业出版社,2005.

[4] 李彦超,蔡宝昌,李伟东,等.马钱子总生物碱的测定及其提取条件的正交设计优选[J].中药新药与临床药理,2004,15(1):4346.