【摘要】  目的：探讨EPO在骨肉瘤组织中的表达及意义。方法 ：收集武汉市四大三级甲医院的骨肉瘤20例及良性骨软骨瘤5例,将实验分为骨肉瘤组(n=20)和良性骨软骨瘤组(n=5),采用免疫组织化学方法检测各组组织中EPO的表达水平, 采用HPIAS1000图文报告管理系统对EPO的表达进行定量分析，并用SPSS13.5软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q)检验。结果：EPO在骨肉瘤组织中呈高表达, EPO在良性骨软骨瘤组织中呈低表达, EPO在骨肉瘤组织中的表达与良性骨软骨瘤组织的表达比较差异有显著性(P<0.05)。结论：EPO在肿瘤的发生发展等过程中起了重要作用。

【关键词】  骨肉瘤; EPO; 免疫组织化学; 图像分析; 统计分析

　骨肉瘤是原发于骨组织的最常见的恶性肿瘤，发病年龄多位于11～20岁，其次为21～30岁。此类肿瘤恶性程度高，常危及患者生命[1]。骨肉瘤发病率占骨肿瘤的20%，占恶性骨肿瘤的76.2%，好发于青少年，易早期肺转移，进展快，预后差。其发生机制不明确[2，3]。

　　最近多项研究证实促红细胞生成素 ( EPOR)在多种原发恶性肿瘤及肿瘤细胞株中表达 ,可以调节肿瘤细胞的生长发育 ,引起恶性肿瘤新生血管的生长。EPO转录产物和EPOR蛋白的表达在人肾癌细胞[4],子宫颈癌和卵巢癌等女性生殖系统肿瘤,以及乳腺癌[5]和前庭神经鞘瘤[6]中被证实。目前 EPO在肿瘤组织的表达及对肿瘤生长的作用国外仅在肾癌、 卵巢癌、 乳腺癌等少数肿瘤中有所研究 ,在骨肉瘤中的表达,国内相关研究报道较少。

　　本研究通过应用免疫组织化学方法和图像分析技术检测骨肉瘤及良性骨软骨瘤组织中EPO的表达水平，并进行了统计学分析，探讨EPO在骨肉瘤发生、发展过程中的作用，为临床上防治骨肉瘤提供理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 材料来源及分组

　　收集武汉市四大三级甲医院病理科2000～2008年骨肉瘤存档蜡块20例及良性骨软骨瘤存档蜡块5例。所有切片经病理学专家诊断为骨肉瘤及良性骨软骨瘤。

　　1.1.2 材料

　　采用免疫组织化学SP法检测EPO在骨肉瘤与良性骨软骨瘤组织中的表达。

　　1.2 主要试剂和仪器

　　1.2.1 主要试剂

　　①EPO兔抗人多克隆抗体(北京中山生物技术有限公司);②超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒(福州迈新公司);③DAB显色试盒及多聚赖氨酸(北京中山生物技术有限公司)。

　　1.2.2 主要仪器 ① YWY781型医用微波仪，250 W，50 Hz (浙江临安电子器材厂生产);②家用高压锅;③电热恒温干燥箱 (湖北黄石医疗器械厂生产);④显微镜成像系统 (Olympus公司)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 蜡块切片厚5μm，贴片于涂有多聚赖氨酸的洁净载玻片上，置于烤箱烤干待用。

　　1.3.2 免疫组织化学SP法检测EPO相关抗原

　　具体步骤：① 4μm组织切片常规脱蜡至水后，0.01M PBS(pH7.4)漂洗3×3 min;② 抗原修复(柠檬酸缓冲液微波抗原修复法)，室温自然冷却后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗5×3 min;③ 滴加3%过氧化氢，37℃湿盒孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;④ 正常羊血清37℃湿盒孵育10min以减少非特异性背景;⑤ 甩去多余血清，分别滴加一抗，4℃孵育过夜，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5 min;⑥ 滴加生物素标记的二37℃湿盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;⑦ 滴加链霉素抗生物素蛋白过氧化物复合物37℃湿盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;⑧ 滴加新鲜配置的DAB显色液显色，光镜下控制反应时间(约3～5 min)，自来水冲洗终止反应;⑨ 苏木素复染，流水冲洗，1%盐酸酒精分色数秒，流水冲洗，0.1%氨水返蓝;⑩ 梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片并镜检;用PBS代替一抗作为阴性对照组，购买的阳性片作为阳性对照组。

　　1.3.3 免疫组织化学结果判断

　　EPO阳性染色为棕黄色颗粒，定位于细胞膜和胞质内。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。

　　采用HPIAS1000 高清晰度彩色病理图文报告管理系统(同济千屏影像公司)对EPO的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400) ,测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积,计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值(阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%)。

　　1.4 统计学处理

　　数据以均数±标准差表示，用SPSS11. 5 软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q) 检验，检验水准α为0.05。

　　2 结果

　　在骨肉瘤组中可见密集分布的棕黄色颗粒，EPO表达强;在良性骨软骨瘤组中可见少量的棕黄色颗粒，EPO表达弱或无表达。图像分析结果显示: 骨肉瘤组EPO表达的平均光密度为0.3571±0.0097, 良性骨软骨瘤组EPO表达的平均光密度为0.0982±0.0043; 骨肉瘤组EPO表达的阳性面积率为0.3209±0.0087, 良性骨软骨瘤组EPO表达的阳性面积率为0.0980±0.0046。经单因素分析骨肉瘤组与良性骨软骨瘤组比较，差异有显著性(P<0.05)。见表1。表1 骨肉瘤组与良性骨软骨瘤组EPO表达的平均光密度和阳性面积率

　　3 讨论

　　骨肉瘤约占所有骨肿瘤的20%，根据WHO分类可分为普通型(90%)和独立型(10%)。其恶性程度高，好发于青少年，易复发和转移，预后差。近年来，随着肿瘤分子生物学的发展，骨肉瘤的发生及转移机制在分子水平有了一定的认识。目前骨肉瘤的治疗仍以手术治疗为主,放、化疗和生物治疗为辅的综合治疗为主要手段, 5年生存率由上世纪70年代前的15% ～20%提高到目前的80%左右。随着免疫学、分子生物学等相关学科的发展和完善,人们对骨肉瘤的发生机制在分子水平上有了更深的认识。骨肉瘤的发生是多基因、多步骤、多阶段、多重损伤并存的过程,骨肉瘤的基因表达不仅决定骨肉瘤的发生、发展和预后,而且也影响骨肉瘤治疗效果[7，8]。因此, 近些年有许多学者着重研究骨肉瘤的分子发病学, 为观察骨肉瘤预后和转移寻找新的指标, 也为寻找骨肉瘤新的治疗方法提供了理论基础。

　　EPO是一种抗凋亡因子[9],介导多种细胞抗凋亡作用,从而发挥器官保护作用。Koury等报道EPO调节红细胞生成的一种主要机制就是防止红系祖细胞凋亡。此外, EPO还具有减少神经元、心肌细胞、肾小管上皮细胞[10，11]、视网膜神经节细胞(RGCs)[12]、血管内皮细胞及人乳腺癌细胞(MCF7)凋亡的作用。EPO的生物作用是通过相应靶细胞膜表面受体(Erythropoietin receptor, EPOR)介导的。已证实的有肾癌、肝细胞恶性肿瘤、小脑胶质瘤、子宫肿瘤、脑脊膜瘤、嗜铬细胞瘤、醛固酮腺瘤和胃癌等[13，14]多种肿瘤细胞表达EPO、EPOR。

　　本实验结果显示， EPO在骨肉瘤的表达明显高于对照组(P<0.05)，EPO在骨肉瘤组与对照组比较(P<0.05)，差异有显著性。Westenfelder等[15]的实验表明人的肾癌细胞以及肾癌细胞株(CASI2 ,7860)都表达EPOR ,而且重组EPO能促进体外培养的肾癌细胞株增殖;女性生殖系统恶性肿瘤细胞表达EPO和EPOR 的mRNA,对 EPO 呈剂量依赖性,EPO 缺乏可导致肿瘤细胞和毛细血管内皮细胞的凋亡,这些提示EPO可能抑制细胞凋亡而使其增殖。结果证实EPO在肿瘤发生发展等过程中起了重要作用。

【参考文献】
  　　1 Meyers P, Schwartz C, Krailo M, et al. Osteosarcoma: A randomized, prospective trial of the addition of ifosfamide and/or muramyl tripeptide to cisplatin, doxorubicin, and highdose methotrexate. J Clin Oncol,2005,23(9): 2004～2011.

　　2 Mialou V, Philip T, Kalifa C, et al. Metastatic osteosarcoma at diagnosis: prognostic factors and longterm outcomethe French Pediatric Experience. Cancer,2005,104(5): 1100～1109.

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　　12 Cai Z, SemenzaGL.Phosphatidylinositol3Kinase Signaling Is Required for ErythropoietinMediated Acute Protection Against Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury. Circulation, 2004 , 109 (17) : 2050～2053.

　　13 Yang CW, Li C, Jung JY, et al. Preeonditioning with erythropoietin protects against subsequent ischemiareperfusion injury in rat kidney. Faseb J, 2003, 17 (12) :1754～1756.

　　14 Tezel G, Yang XJ,Luo C, et al. Hemoglobin Expression and Regulation in Glaucoma: Insights into Retinal Ganglion Cell Oxygenation. Investigative Ophthalmology & Visual Sclence,2010,51(2),907～919.

　　15 Westenfelder C, Robert L.Erythropoietin stimulates proliferation of human renal carcinoma cells.Kidney Intern,2000,58:647～657.