【摘要】  目的：探讨丹参注射液对幼年大鼠应激性溃疡（SU）粘膜损伤预防作用及可能机制。方法：将36只幼年大鼠随机分成6组，即正常对照组、应激3 h组（Ⅰ组）、应激前腹腔注射生理盐水2 mL+应激3 h组（Ⅱ组）、应激前腹腔注射丹参2次+应激3 h组（Ⅲ组）、应激前腹腔注射丹参4次+应激3 h组（Ⅳ组）、应激前腹腔注射丹参6次+应激3 h组（Ⅴ组），采用束缚水浸法制作应激性溃疡动物模型，检测各组胃粘膜溃疡指数（UI）、胃粘膜血流量（GMBF）及胃组织超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）、肿瘤坏死因子（TNFα）含量变化。结果：（1）丹参可明显减轻损伤模型中的UI；（2）丹参能明显降低幼鼠胃组织和血清MDA含量，增加胃组织和血清SOD活性；（3）丹参可以降低幼鼠胃组织中TNFα的水平。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组TNFα值均低于Ⅰ组，且依次递减，Ⅴ组与Ⅰ组相比差异有统计学意义（P<0.05）。结论：丹参对应激性溃疡具有预防作用，其机制与改善胃微循环、抗氧化清除自由基及通过对单核巨噬细胞分泌TNFα的调节等作用有关。

【关键词】  丹参；应激；胃粘膜；溃疡；自由基；肿瘤坏死因子

         An Experimental Study on the Mechanisms of Radix Salviae Miltiorrhiae Injection against Gastric Stress Ulcer Produced by Water ImmersionZHAO Jie, ZHANG WenZibo Central Hospital, Shandong Province, Shandong Zibo  255036, China   ［Abstract］ Objective: To investigate the prophylactic effect of Radix Salvia Miltiorrhiae Injection (RSM) on acute gastric mucosal injury and to explore possible mechanism in young rats.Methods: Thirtysix SD young rats were randomly divided into six groups. Different times of RSM (2 times, 4 times and 6 times per rat before gastric mucosal injury induced by water restraint stress) were used to treat the rats, then the change of gastric mucosal ulcer index (UI), pH of gastric juice, gastric mucosal blood flow (GMBF), the activity of SOD, the concentration of MDA and TNFα in gastric mucosa were measured, and a comparison was made among all the groups. Results:(1) RSM could remarkably decrease injury index and the concentration of MDA and TNFα in gastric mucosa; (2) RSM could significantly increase gastric mucosal blood flow (GMBF) and the activity of SOD; (3) RSM could markedly decrease the TNFα level of young rats in stomach tissue (P<0.05). Conclusions:RSM has a good protective effect on gastric stress ulcer caused by water immersion in young rats. The mechanism may be related to its increase of GMBF, the antioxidantive ability which can reduce injury induced by free radicals, and reduction of the levels of TNFα in gastric tissue. ［Key words］ Radix Salvia Miltiorrhiae; Stress; Gastric mucosa; Ulcer; Free radicals;TNFα　应激性溃疡（Stress Ulcer，SU）是机体在各类严重创伤、危重疾病等应激状态下，发生的急性消化道粘膜糜烂、溃疡等病变，可在应激原作用后数小时内出现。应激相关的胃肠道损伤在危重患者中发病率很高，可引起严重临床并发症，如出血、胃肠穿孔等。危重患者极易出现消化道应激性溃疡、出血及中毒性肠麻痹，如继续发展，可累及全身其他器官，最后发展为多器官功能障碍综合征和（或）多系统器官功能衰竭。SU作为重症患者病情加重或恶化的标志之一，应引起临床高度重视。尽管目前医疗技术方面有很大进展，上消化道出血仍是延长住院时间的一个重要原因。因而预防SU的发生尤为重要，已日益受到许多学者的重视，2002年在上海召开的SU预防研讨会制定了系统防治方案。大量关于SU预防的研究，由于缺乏随机对照、大样本调查，而且许多研究包含多病种患者群体，可变因素太多，所以无法得出合适的SU预防措施。在前期研究中，我们已经证实了丹参对幼年大鼠应激性溃疡有明显预防或减轻发病程度作用［1］，为了进一步探讨其作用机制，我们通过给予幼年大鼠腹腔注射丹参，然后建立幼年大鼠束缚水浸应激性溃疡模型，探讨丹参的量与UI、胃粘膜血流量（GMBF）、自由基及TNFα的变化的关系，丹参对SU预防作用的可能机制，对丹参进一步的研究有望为预防应激性胃粘膜损伤提供新的方法及理论依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物与材料

　　1.1.1  实验动物  健康纯种雄性幼年SD大鼠 36只，年龄2～4周，体重80～100 g，由北京大学医学部动物中心提供。

　　1.1.2  主要试剂 

　　丹参注射液由北京双鹤药业提供；其他试剂均为分析纯。

　　1.1.3  药物及用量 

　　应激前腹腔注射生理盐水2 mL+应激3 h（Ⅱ组）于应激前腹腔注射生理盐水2 mL、应激前腹腔注射丹参2次+应激3 h（Ⅲ组）、应激前腹腔注射丹参4次+应激3 h（Ⅳ组）、应激前腹腔注射丹参6次+应激3 h（Ⅴ组）分别应激前腹腔注射丹参注射液2次、4次、6次（2 mL/次，1次/8h）后进行应激试验，对照组及应激3 h（Ⅰ组）不给予任何药物［2］。

　　1.1.4  主要仪器 

　　FT630G微机放免仪（北京核仪器厂）；Sigma 4K15低温冷冻离心机（德国）；TGLL16低温高速离心机（北京大恒建海科贸公司）；UV1601紫外/可见分光光度计（日本Shimadzu Corporation）；分析天平ER182A（日本东京A&D Company Limited）；电热恒温水浴箱（北京福绥境医疗器械厂）；WH866旋涡混合器（北京科尔德科贸有限公司）；电动组织匀浆器（Kultra Turrax Ika T18 basic）；小型三用水箱（北京市医疗设备总厂）；pH检测仪（Mettler Toledo 320 pH meter）；Perimed激光多普勒血流仪及分析软件（瑞典百灵威公司）。

　　1.2  动物分组及建立模型
     
　　36只健康幼鼠随机分成6组，每组6只，实验前禁食24 h，禁水1 h，在乙醚轻度麻醉下，将四肢及头部束缚于鼠板上，待清醒后将鼠板垂直浸入（19±1）℃水浴中，水面平胸骨剑突，持续时间除正常对照组均为3 h。据应激前用药及次数的不同分为5组：Ⅰ组仅应激3 h，不给予任何药物；Ⅱ组应激前腹腔注射生理盐水2 mL、Ⅲ组应激前腹腔注射2次丹参、Ⅳ组应激前腹腔注射4次丹参、Ⅴ组应激前腹腔注射6次丹参；正常对照组仅予以乙醚麻醉，不做其他处理。

　　1.3  实验步骤
    　　
　　幼鼠乙醚麻醉后，剑突下正中切开腹壁，轻轻分离游离并固定胃，探头轻触胃体并与胃表面保持垂直，待血流稳定后，在胃体、大小弯处取3点测定胃粘膜血流（GMBF），取其均值，以激光多普勒信号电压值（PU）表示血流量的相对数值。先结扎幽门部，然后采集门静脉血，再结扎贲门，取胃处死大鼠。沿胃大弯切开使胃粘膜外翻，经冰生理盐水漂洗后，观察胃粘膜改变，展平胃，将一块透明的方格板压在全胃上（格间距0.2 mm），用显微镜观察损伤情况，按改良Guth法计算胃粘膜损伤指数：全胃各病灶长度之和为损伤指数，损伤长度<1 mm（包括糜烂点）为1分；1～2 mm记2分；2～3 mm记3分；3～4 mm记4分；>4 mm分段测量。若损伤宽度>2 mm者将其计数加倍。刮下粘膜、粘膜下层及肌肉层，称重后置入电动匀浆管中，按10%组织浓度加入生理盐水充分匀浆，16 000 r/min上下研磨，匀浆时间10 s/次，间隙30 s，连续3～5次，在冰水中进行，将制备好的10%匀浆离心，3 000 r/min离心15 min，取上清液，-20 ℃以下保存待测。

　　1.4  实验观察及测定项目

    测定胃粘膜损伤指数、胃液pH值、胃粘膜血流量（GMBF）。先用考马斯亮兰法测定组织匀浆蛋白含量，采用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶（SOD）活力，采用硫代巴比妥酸显示法测定丙二醛（MDA）。采用放免法测定胃粘膜组织TNFα，按试剂盒操作说明进行。

　　1.5  统计学处理

　　数据以均数±标准差表示，应用SPSS10.0统计软件包，采用单因素方差分析（F检验和q检验），P<0.05表示差异有统计学意义，两变量之间的关系采用直线相关分析。

　　2  结果

　　2.1  胃粘膜溃疡指数、胃粘膜血流量及胃液pH值的变化
        
　　结果见表1。正常对照组胃粘膜无损伤，Ⅰ、Ⅱ组胃粘膜溃疡指数分别为57.75±5.71、55.63±7.52，两者之间差异无统计学意义，而与对照组相比差异有统计学意义。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组胃粘膜溃疡指数逐渐降低，其中Ⅳ和Ⅴ组与Ⅰ组相比，差异有统计学意义（P<0.01）。表明在束缚水浸应激前给予不同剂量的丹参注射液（2次、4次和6次），应激3 h后胃粘膜损伤受到不同程度的抑制。表1  复方丹参注射液对应激性大鼠UI、GMBF及胃液pH值的影响（略）注：与正常对照组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与应激3 h组比较，★P<0.05，★★P<0.01

    Ⅰ组与正常对照组比较，GMBF差异有统计学意义（P<0.01）；Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组GMBF与Ⅰ组相比较，差异有统计学意义（P<0.01），与其剂量呈正相关。

    Ⅰ组与对照组比较，胃液pH值差异有统计学意义（P<0.01），Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组与Ⅰ组比较，差异均无统计学意义（P>0.05），表明束缚水浸应激条件下幼鼠胃酸随丹参应用次数的增多，胃液pH值增加不明显。

　　2.2  血清及胃组织中SOD、MDA的变化
   
　　结果见表2。Ⅰ组及Ⅱ组幼鼠胃组织SOD活性较对照组明显降低（P<0.01），Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组SOD活性逐渐升高，其中Ⅳ、Ⅴ组SOD活性与Ⅰ组比较差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；Ⅰ、Ⅱ组幼鼠胃粘膜MDA含量较对照组明显升高，与Ⅰ组相比，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组MDA含量下降，其中Ⅳ、Ⅴ组与Ⅰ组比较差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），Ⅴ组与对照组MDA含量相当（P>0.05）。Ⅰ组SOD/MDA比值与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），Ⅴ组SOD/MDA比值明显高于Ⅰ组（P<0.01）。表2  胃组织中SOD和MDA水平的变化（略）注：与正常对照组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与应激3 h组比较，★P<0.05，★★P<0.01

    血清中Ⅰ组较对照组SOD降低明显（P<0.01），MDA升高显著（P<0.01），SOD/MDA比值降低显著（P<0.01）。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组SOD、SOD/MDA比值有升高趋势，MDA有降低趋势，且差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。

　　2.3  胃组织TNFα变化
   
　　结果见表3。Ⅰ组TNFα高于对照组（P<0.01），Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组TNFα值均低于Ⅰ组，且依次递减，Ⅴ组与Ⅰ组相比差异有统计学意义（P<0.05）。表3  胃组织TNFα水平变化的比较（略）注：与正常对照组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与应激3 h组比较，★P<0.05，★★P<0.01

　　3  讨论
   
　　随着对丹参药理研究的不断深入，丹参的多种药理特性不断地被发现和应用于非脑血管疾病，临床观察和动物实验都证明它具有广泛而复杂的药理作用。丹参对消化性溃疡的治疗作用近几年颇受关注。王国中等［3］在大鼠乙酸胃溃疡急性期用丹参治疗结果表明：丹参有促进溃疡愈合防止再发的作用。还有实验表明，丹参对大鼠浸水冷拘束应激性溃疡的形成有明显的抑制作用［4］。张向荣等［5］荟萃分析丹参对实验性胃粘膜损伤具有保护作用，对急、慢性溃疡均有一定治疗并防止复发的作用。至此，对丹参在胃酸分泌、胃粘膜保护等方面的作用有了多方面进展。杨卫文等［6］将其用于治疗消化性溃疡，治愈率为69.4%，合用H2受体阻滞剂时疗效更为显著。临床应用丹参治疗消化性溃疡的资料尚少，对其机制尚在探索阶段。至于其胃粘膜保护的机制尚未阐明，只限于动物实验阶段，尤其是对新生儿或鼠SU的作用目前无人报道。
    在我们的实验观察到，束缚水浸应激可致胃粘膜溃疡指数UI明显增高，而在应激前先给予腹腔注射丹参注射液可降低胃粘膜溃疡指数UI，随应激前应用丹参的次数增多，UI下降越明显，证实丹参对幼年大鼠水浸束缚应激性溃疡具有预防作用，能够减轻胃粘膜损伤程度。
   
　　应激性胃粘膜损伤的发生是机体在严重应激状态下，由于胃粘膜损伤因素相对增强、胃粘膜的防御保护作用削弱及机体的神经内分泌功能失调等综合作用的结果。其发病可能与下列因素有关［7，8］：胃粘液分泌减少、胃粘膜血流量减少、氧自由基损伤、胃酸和胃蛋白酶分泌增加。丹参对消化性溃疡的治疗作用机制并不十分清楚，目前认为，其抗溃疡作用主要在于增强胃粘膜的防御功能，而不是降低胃粘膜的攻击因子。丹参抗溃疡作用的机制是由多种因素构成的，丹参在胃的微循环方面有调节作用，同时有人证实它也是胃肠道运动的调节剂和自由基清除剂［9］。
   
　　众所周知，丹参具有改善微循环的作用，炎症发生时的细胞缺血缺氧状态可得到改善。张超等［10］利用大鼠肠结扎穿孔动物模型，观察到严重腹腔感染时胃粘膜血流量和胃粘膜内pH值降低，而丹参在应激状态下可能通过增加GMBF参与了胃粘膜细胞的能量代谢过程，导致pH值升高，从而使胃粘膜屏障功能免受致损因子的攻击，减少应激性胃粘膜损害的发生。在本试验中，束缚水浸应激致使GMBF明显下降，丹参的应用可部分逆转GMBF的下降，且出现改变要早于自由基及TNF等的改变，提示丹参抗溃疡的作用机制以改善胃的微循环为主。胃粘膜血流量的增加，可增加粘膜的血氧供给，进而增加了H+的排出和胃蛋白酶的代谢，导致胃液量减少和胃内总酸度降低。丹参使胃粘膜小动脉和毛细血管扩张，增加胃粘膜的血流，改善血液循环，纠正缺血、缺氧状态。本实验观察到应用丹参2次，胃粘膜血流量增加11.2%，应用 4次及应用6次分别增加38.3%和69.0%，即随丹参应用次数的增多，GMBF逐渐增加，同时也观察到胃液pH值的变化不明显，各预防用药组与应激3 h组相比差异均无统计学意义（P>0.05），说明丹参对胃酸分泌的影响不明显，胃液pH值升高存在滞后性，考虑其增加可能是由于GMBF增加，H+的排出增多，胃蛋白酶的代谢发生了变化而引起的，另外也推测丹参对胃酸分泌的影响不是其抗溃疡作用的主要机制。
   
　　氧自由基是一类具有高度化学反应活性的含氧基团，通过脂质过氧化及共价结合等方式造成组织损伤，已证明氧自由基在应激性溃疡的发病中有重要作用。乳过氧化物酶（LPO）是非常活跃的脂自由基，对组织细胞的损害作用非常广泛，它能损害生物膜，使其通透性增加而易于破裂。MDA是LPO的代谢产物，其含量增高反应了LPO的生成增加。现公认体内抗氧化物质SOD活性下降与MDA含量上升有关，是较好地反映体内氧自由基损伤的指标［11］。本实验结果表明，应激3 h组（Ⅰ组）及生理盐水组（Ⅱ组）幼鼠胃组织SOD活性较对照组明显降低（P<0.01），MDA含量较对照组（Ⅰ组）明显升高，因此认为胃粘膜氧自由基产生增多和抗氧化酶的减少是SU发生的重要因素。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组SOD活性逐渐升高，MDA含量下降，其中Ⅳ组、Ⅴ组与Ⅰ组比较明显（P<0.05或P<0.01）；Ⅰ组SOD/MDA比值与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），Ⅴ组SOD/MDA比值明显高于Ⅰ组（P<0.01），相关分析提示胃粘膜损伤指数与胃组织中MDA含量呈正相关（r=0.883，P<0.01），而与胃组织中SOD含量呈负相关性（r=-0.508，P<0.01）。另外血清中SOD活性、MDA含量的改变也很好地证实了这一点。当用丹参预处理时，则能显著提高血中SOD含量和降低MDA含量。因此可认为丹参减轻胃粘膜损伤，而对胃粘膜的保护作用，与增强抗氧化酶SOD的活性、清除应激状态下过多产生的自由基有关。
    　　
　　本实验发现，应激3 h，胃组织中TNFα水平显著升高，同时出现明显的胃粘膜损伤，病理学检查发现有大量白细胞附壁。在应激实验前给予不同次数的丹参，胃粘膜的损伤程度及胃组织TNFα水平均有降低。表明该药具有减少炎症细胞因子刺激的作用，因而能够减轻胃粘膜损伤程度。总之，本研究结果表明，丹参能够减少束缚水浸诱发胃溃疡幼鼠胃组织TNFα水平，由此推测丹参对单核巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子TNFα具有调节作用，这可能是其可预防应激性溃疡发生的作用机制之一。TNFα是由单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、肥大细胞等产生的一种细胞因子。TNFα一经释放，炎症反应立即被启动。TNFα可促进其它细胞因子包括IL1、IL6、IL8、PAF、PG、LT等的继发性释放并引起中性粒细胞和内皮细胞活化急性期蛋白生成，凝血过程启动产生小血管内凝血，影响粘膜血氧供给，加剧溃疡。丹参能显著地抑制由内毒素诱导的上述因子的大量分泌，提示丹参可能具有抗炎及增强机体免疫这两方面的调节作用［9］。有资料表明，在乙酸诱发大鼠胃溃疡模型中，胃溃疡的底部和边缘部位的单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞中可以检测到TNFα，并且TNFα激活中性粒细胞，使其在胃粘膜固有层持续浸润，因而影响溃疡愈合质量［12］。
    　　
　　目前认为丹参抗溃疡作用机制也是由多种因素构成的，本研究只是局限于丹参抗溃疡作用的几个方面。在本实验研究基础上，可增加实验条件，继续研究丹参预防SU的机制，对丹参进一步的研究有望为预防应激性胃粘膜损伤提供新的方法及理论依据。丹参抗溃疡作用的有效成分非单一成份，其分离和纯化工作也将是目前研究的重点。总之，针对丹参等中药制剂进行一系列有目的的研究，必将有助于临床防治儿童应激性溃疡水平的进一步提高。

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