1立题依据（国内外研究现状、发展趋势和课题的意义，附主要参考文献）
药物在机体内的代谢受到众多因素的影响，其中种族差异对药物药代动力学的影响文献报道较多，在高原低氧特殊环境下，各民族机体生理性变化和身体状况存在一定的差异[1.2.3.4.5.6]，另外各民族的遗传因素和生活饮食习惯有所不同，不同民族对药物的代谢可能存在一定的影响。研究结果表明有些药物在不同种族的代谢有明显差异[7.8.9.10.11]。有关不同海拔地区的相同民族对同一药物代谢的影响，国内研究较少[12.13]，，国际上在这方面的研究相对滞后，目前尚未见到亚高原地区汉族和平原地区汉族对局麻药利多卡因药代动力学影响的资料。
利多卡因为酰胺类局麻药，血液吸收后或静脉给药，对中枢神经系统有明显的兴奋和抑制双相作用，且可无先驱的兴奋，血药浓度较低时，出现镇痛和嗜睡、痛阈提高；随着剂量加大，作用或毒性增强，亚中毒血药浓度时有抗惊厥作用。利多卡因口服生物利用度低，经肝脏首次通过效应即锐减，肌注后吸收完全，吸收后迅速分布入心、脑、肾及其他血运丰富的组织，然后分布至脂肪及肌肉组织。表观分布容积约1L/kg，心力衰竭时分布容积减低，蛋白结合率约51％。利多卡因体内半衰期为2h，利多卡因的局麻效能与持续时间均较普鲁卡因强，但毒性也较大，在肝内代谢的去乙基代谢产物（单乙基甘氨酰胺二甲苯），仍具有局麻性能，毒性加大，所以如果临床给药剂量控制不好，容易发生严重的毒性反应。在临床药学工作中课题组感觉不同海拔地区汉族之间对麻醉药的耐受存在一定的差异，但又没文献依据可查。
综上所述，我们设计了《盐酸利多卡因在不同海拔地区汉族人体内的药代动力学研究》课题，期望通过研究平原地区（如佛山地区）和亚高原地区（如西宁地区海拔2260米）汉族人群体内药代动力学特征，揭示不同海拔地区汉族间对利多卡因体内代谢的特点和差异，为今后不同海拔地区临床药学研究寻找一些有价值的依据，并对不同海拔地区人员合理使用利多卡因起指导作用。
2课题研究目标、研究内容和拟解决的关键性问题
研究目标
本课题拟完成30名平原受试者，30名亚高原汉族受试者汉族人群盐酸利多卡因体内代谢的特点和差异。
研究内容
通过研究不同海拔地区汉族人群盐酸利多卡因体内代谢的特点和差异，为今后不同海拔地区临床药学研究寻找一些有价值的依据，并对不同海拔地区合理使用盐酸利多卡因起一定的指导作用。
拟解决的关键性问题
2.1建立盐酸利多卡因的血药浓度测定和药代动力学研究方法。
2.2研究盐酸利多卡因在平原地区和亚高原地区汉族志愿者体内的药代动力学特征，比较二者代谢差异，初步评价不同海拔地区差异对药物代谢的影响。
3拟采取的研究方法、技术路线及其可行性分析
人血浆中盐酸利多卡因的RP-HPLC测定方法
3.1实验材料
3.1.1试验药品
盐酸利多卡因对照品（中国药品生物制品鉴定所）
2%盐酸利多卡因注射液（制药有限公司，批号：0809291？）
3.1.2试剂
甲醇（色谱纯，山东禹王实业有限公司即产地）
乙腈（色谱纯，山东禹王实业有限公司）
冰乙酸（分析纯，甘肃白银化学试剂公司）
纯净水（杭州娃哈哈食品有限公司）
3.1.3仪器
高效液相色谱仪：LC-10AT泵和SPD-10A 紫外检测器（日本岛津公司）
N2000型色谱工作站（浙江大学智能信息工程研究所）
XW-80A旋涡混合器（上海精科有限公司）
TGL-16B高速离心机（上海安亭科学仪器厂）
3.2盐酸利多卡因结构式
盐酸利多卡因结构式见图1
图1盐酸利多卡因结构式
3.3盐酸利多卡因对照品溶液的配制
精密称取盐酸利多卡因0.2g，置于10ml量瓶中，再于其中加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得1 mg/ml 盐酸利多卡因的储备液。取储备液1 ml置于10 ml量瓶中，再于其中加入甲醇稀释至刻度，摇匀，即得100 μg/ml盐酸利多卡因甲醇溶液；再依次稀释，配成10 μg/ml，1 μg/ml。
3.4血浆样品的处理
于离心管中精密加入血浆样品0.3 ml，涡旋，加入30%的高氯酸0.1 ml，涡旋1 min，于16000 r/min离心10 min，分取上清液，精密吸取20 l进样分析。
3.5色谱条件
流动相：乙腈-甲醇-0.5%冰乙酸溶液（15：20：50，v/v）；
色谱柱：Lichrospher C18（250mm×4.6mm7 m）；
流速：1.0 ml/min；
检测波长：220 nm；
柱温：室温18～24℃；
进样量：20 l；
3.6方法学
3.6.1色谱行为（特异性）
在本实验所采用的色谱条件下，盐酸利多卡因峰形良好，无杂峰干扰测定，基线平稳（见图2）。本方法具有较高的特异性，能准确测定血浆中的盐酸利多卡因的浓度，灵敏度较高。
图2人血浆中盐酸利多卡因的HPLC图
（A）盐酸利多卡因对照品溶液色谱图
（B）空白血浆色谱图
（C）空白血浆加入盐酸利多卡因对照品后的色谱图
（D）给药后的血浆样品色谱图
（峰1为盐酸利多卡因峰，出峰时间在7.7 min左右）
3.6.2标准曲线制备及最低可定量浓度测定
取离心管数支，分别精密加入不同量的盐酸利多卡因标准液后以氮气流吹干，加入空白血浆0.3 ml，涡旋1 min，配成含盐酸利多卡因分别为0.2，0.4，0.8，1.6，3.2，6.4 和9.6 μg/ml的标准血浆，每种浓度做5份样品，按“血浆样品的处理”项下操作，进样分析并记录色谱图，以平均峰面积A对血药浓度（C）作回归计算，得回归方程（见表1、图3）：A = 22600×C + 3741（r = 0.9997）。
按上述条件测得盐酸利多卡因在血浆中的最低定量浓度为0.2 μg/ml（S/N= 10）。
图3盐酸利多卡因标准曲线
表1盐酸利多卡因标准曲线（n=5）
3.6.3精密度试验
取离心管数支，于离心管中精密加入不同量的盐酸利多卡因溶液适量，以氮气流吹干，精密加入0.3 ml空白血浆，涡旋1 min，配成含盐酸利多卡因0.4，3.2，9.6 μg/ml的血浆，按“血浆样品处理”项下操作，在日内和日间（5天）对每种浓度各做5份样品，记录色谱图，计算盐酸利多卡因峰面积A。求得日内和日间相对标准差，结果见表2。
表2HPLC法的日内和日间变异（n=5）
3.6.4回收率试验（绝对回收率）
取离心管数支，分别取盐酸利多卡因对照品溶液适量于离心管中，用甲醇配成浓度分别为0.4，3.2，9.6 μg/ml的盐酸利多卡因甲醇溶液，进样分析，记录色谱图，计录盐酸利多卡因的峰面积As。
另取离心管数支，分别精密加入不同量的盐酸利多卡因对照品溶液适量，以氮气流吹干，精密加入0.3 ml空白血浆，涡旋1 min，配成含盐酸利多卡因0.4，3.2，9.6 μg/ml的血浆，每种浓度各做5份样品。分别加入30%的高氯酸0.1 ml，，涡旋1 min，于16000 r/min离心10 min，分取上清液，精密吸取20 l进样分析。记录色谱图，计算盐酸利多卡因的峰面积Ax。上述Ax和As的比值即为盐酸利多卡因的绝对回收率（R%），即 R% = Ax/As×100%。结果见表3。表3血浆中盐酸利多卡因绝对回收率（MeanSD，n=5）
3.6.5准确度试验（相对回收率）
将前述日间精密度试验中0.4，3.2，9.6 μg/ml系列血浆的盐酸利多卡因峰面积代入前述标准曲线方程，计算所得浓度和加入浓度的比值即为相对回收率，结果见表4。
表4血浆中盐酸利多卡因相对回收率（MeanSD，n=5）
3.6.6冻融试验
取离心管数支，分别精密加入相同量的盐酸利多卡因对照品溶液适量，以氮气流吹干，精密加入0.3 ml空白血浆，涡旋1 min，配成含盐酸利多卡因3.2 μg/ml的血浆，共做9份样品，分别冷冻保存0，1，10，20，30，40，50，60，90天后，按“血浆样品处理”项下操作，记录色谱图和盐酸利多卡因峰面积A，计算得 RSD为3.98%。
3.7结论
3.7.1本课题建立的人血浆中盐酸利多卡因的RP-HPLC测定法，血浆中杂质不干扰样品的测定，标准曲线线性关系良好（r = 0.9997）；最低定量浓度为0.02 μg/ml；高、中、低三种浓度的日间和日内变异符合生物药物分析的要求；绝对回收率为87.07~94.17%；相对回收率为95.09~111.14%。
3.7.2本课题建立的RP-HPLC测定方法简便、准确、灵敏度高，适合于人血浆中盐酸利多卡因的测定及药代动力学研究。
4盐酸利多卡因在不同海拔地区志愿者体内的药代动力学研究
4.1受试者
4.1.1受试者选择依据及要求
受试者均来自本院门诊志愿者。
受试者分组
平原组：18名健康男性受试者，均为平原世居居民。现在佛山地区生活20年以上。
亚高原组：18名健康男性受试者，均为青藏高原汉族世居居民。均来自世居海拔高度2300-2600m的人群，在亚高原地区生活20年以上，现在佛山地区生活少于0.3年。具体条件如下：
1)性别：男性；
2)民族：汉族；
3)年龄：20～24岁；
4)体重：同一批受试者体重（kg）不宜悬殊过大；标准体重＝[身高（cm）-80]×0.7或[身高（cm）-170]×0.6+62。一般要求在标准体重±10％范围内；或体重指数[BMI＝体重（kg）/身高（M）2]在20～24范围内；
5)不吸烟；不嗜酒；
6)身体状况：无心、肝、肾、消化道、神经系统、精神异常及代谢异常等病史；体格检查示血压、心率、心电图、呼吸状况、肝、肾功能和血象无异常；
7)两周前至整个实验期间不服用其它任何药物；
8)3个月内未用过已知对某脏器有损害的药物；
9)3个月内未参加献血者；
10)签约知情同意书；
不符合上述要求之一者，不得作为受试者人选。
4.1.2中止试验条件
1）受试者出现严重不良反应；
2）实验期间生病，需要接受治疗；
3）受试者要求中止试验；
4）其它原因如受试者不按实验要求等。1.3 现有受试者资料
4.1.3现有受试者资料
来自本院门诊志愿者，18名平原受试者平均年龄21.83±0.79岁，平均身高1.73±0.04 m，平均体重61.22±4.67Kg；18名亚高原汉族受试者平均年龄21.35±1.11岁，平均身高1.73±0.06m，平均体重57.94±5.72Kg。2组志愿者间身高、体重和年龄均无统计学差异（均为P>0.05）。两组经全面体检身体健康。实验前两周及实验期间未服用其它任何药物。实验期间统一饮食。一般资料见表5和表6。
表5平原组受试者身体状况及实验分组情况
表6亚高原组受试者身体状况及实验分组情况
4.1.4受试者分组
平原组：18名健康男性受试者，均为平原世居居民。
亚高原组：18名健康男性受试者，均为青藏高原汉族世居居民。
4.2实验方案
4.2.1给药
平原组：18名健康男性受试者臀部肌肉注射2%盐酸利多卡因注射液10ml（0.2g/人）。
亚高原组：17名汉族健康男性受试者臀部肌肉注射2%盐酸利多卡因注射液10ml（0.2g/人）
受试者于试验前1日和试验期内均勿饮用酒类和咖啡类饮料；试验前禁食过夜至少10小时（不禁水）。于当日早晨8：00空腹臀部肌肉注射2℅盐酸利多卡因注射液10ml；注药2小时后方可再饮水，2小时后统一进餐。受试者服药后应避免剧烈运动，亦不得长时间卧床，在医护人员的监护下在一定区域适度活动。
4.2.2样品采集
受试者于注药后0，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，6.0，8.0 h采血3ml于标准肝素试管中，分离出血浆，－20℃保存待测。
4.3临床观察内容
试验工作在临床试验观察室进行。受试者应得到医护人员的监护。受试期间发生的任何不良反应，均应及时处理和记录.
4.4数据分析
4.4.1药动学参数的估算
曲线下面积（AUC）按下列各式估算
式中C为服药后小时的血药浓度，λz为末端相消除速率常数。对血药log对数浓度－时间数据的末端进行直线回归，所得斜率的绝对值乘以2.303即为λz。
4.4.2统计分析
采用SPSS 13.0 统计分析软件对不同海拔地区受试者盐酸利多卡因注射液的主要药代动力学参数进行统计分析。
5血药浓度测定
按“（二）”项下所建立的方法采用高效液相色谱法测定盐酸利多卡因的血药浓度。
6结果
6.1血药浓度-时间数据
平原组受试情况请你按照亚高原组做出图谱。17名高原受试者肌肉注射盐酸利多卡因注射液后血浆中盐酸利多卡因的浓度-时间数据分别见表8和图7、图8和图9。图7显示的是每一名受试者肌肉注射盐酸利多卡因注射液后的血药浓度－时间曲线，一共有18个图；图8显示的是17名受试者肌肉注射盐酸利多卡因注射液后的平均血药浓度－时间曲线；图9显示的是17名受试者肌肉注射盐酸利多卡因注射液后，血浆中盐酸利多卡因浓度－时间数据分散情况。
图817名亚高原受试者肌肉注射盐酸利多卡因注射液后（0.2g）
盐酸利多卡因的平均血药浓度－时间曲线
图917名亚高原受试者肌肉注射盐酸利多卡因注射液后（0.2g）
盐酸利多卡因的血药浓度－时间曲线
图10不同海拔地区受试者肌肉注射盐酸利多卡因注射液后（0.2g）
盐酸利多卡因的平均血药浓度－时间曲线
表7平原受试者肌肉注射盐酸利多卡因注射液后后不同时间
表8亚高原受试者肌肉注射盐酸利多卡因注射液后后不同时间
6.2药代动力学参数
采用DAS 2.0 软件计算志愿者给药后的药代动力学参数。18名平原组健康男性志愿者肌肉注射盐酸利多卡因注射液后（0.2g）盐酸利多卡因的药代动力学参数见表9，亚高原组17名健康男性志愿者肌肉注射盐酸利多卡因注射液后（0.2g）盐酸利多卡因的药代动力学参数见表10。
表918名平原健康男性志愿者肌肉注射盐酸利多卡因注射液后（0.2g）
表1017名高原健康男性志愿者肌肉注射盐酸利多卡因注射液后（0.2g）
7 统计分析
采用SPSS13.0统计软件对藏族和汉族的主要药代动力学参数进行t检验比较分析，结果见表11。
表11平原和高原的主要药代动力学参数统计分析结果（x±SD） 由上表可见盐酸利多卡因的主要药代动力学参数半衰期t1/2比平原地区延长0.小时。而盐酸利多卡因的达蜂时间Tmax、达峰浓度Cmax、清除率CL 、表观分布体积V、曲线下面积 AUC（0-t）平均驻留时间MRT（0-t）在平原和高原之间由有无显著性差异。
8计划进度、预期成果及效益分析
（一）、课题研究实施过程包括以下几个阶段：
1．课题研究准备阶段（2010年7月至2010年9月）：查阅文献，课题设计，布置课题实施计划，组织课题组成员分工，熟悉实验方法，联系试剂，并进行部分预实验。
2．课题研究方法建立（2010年10月至2010年12月）：建立盐酸利多卡因的血药浓度测定和药代动力学研究方法。
3．课题研究实施阶段（2011年1月至2011年9月）：盐酸利多卡因在西宁地区藏族和汉族志愿者体内的药代动力学研究。
4．课题总结及申请评价（2011年10月至2011年12月）：总结整理资料，撰写发表论文，组织课题研究报告，完成课题查新工作，申请课题评价。（二）、预期成果及社会经济效益
药物的体内代谢受许多因素的影响，低氧是影响因素之一，而亚高原显著的环境特点之一是低氧。同时临床合理用药要考虑个体条件和环境因素。本研究发现亚高原地区盐酸利多卡因体内药代动力学特点在西宁地区体内半衰期比平原地区延长0.5－1小时。研究结果为今后亚高原地区临床药学研究奠定了一定的基础，并对亚高原地区临床使用盐酸利多卡因提供了一定的理论依据，对临床合理用药具有一定的指导意义。
9研究工作已具备的条件
1．本课题目前已建立了人血浆中盐酸利多卡因的RP-HPLC测定法，血浆中杂质不干扰样品的测定，标准曲线线性关系良好（r = 0.9997），最低定量浓度为0.02 μg/ml，高、中、低三种浓度的日间和日内变异符合生物药物分析的要求，绝对回收率为87.07~94.17%，相对回收率为95.09~111.14%。该测定方法简便、准确、灵敏度高，适合于人血浆中盐酸利多卡因的测定及药代动力学研究。
2．采用肌肉注射的给药方式，盐酸利多卡因在高海拔地区志愿者的体内代谢过程符合一房室模型。
3．与平原组资料比较，发现西宁地区志愿者盐酸利多卡因的体内半衰期均延长？提示盐酸利多卡因在平原和亚高原地区的体内代谢存在一定的差异，在西宁地区临床使用盐酸利多卡因时不能参照平原地区的使用剂量，而要根据西宁地区特点适当延长给药间歇，以减少药物不良反应的发生。
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